苑 偉，楊 慧，謝 勇，傅穎珺*

(1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330006;2.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，江西南昌 330006;3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江西南昌 330006)

細(xì)菌內(nèi)毒素又稱脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)，為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，是創(chuàng)傷、感染等引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征的重要致病因子［1］。在嚴(yán)重感染機(jī)體中，機(jī)體免疫功能的紊亂是導(dǎo)致感染患者死亡的重要原因［2］。研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)內(nèi)存在一類CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 (Treg)，不僅能抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞，還能參與免疫調(diào)節(jié)，分為天然的和誘生的，均能夠抑制體外CD4+T細(xì)胞的增值和體內(nèi)免疫應(yīng)答，與自身免疫活動的異常密切相關(guān)［3］。

連翹酯苷A(Forsythoside A)是從連翹中提取的苯乙醇苷類中藥單體，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用［4］。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中藥連翹具有很強(qiáng)的摧毀細(xì)菌內(nèi)毒素和免疫調(diào)節(jié)等作用［5-6］，其開發(fā)利用的前景十分廣闊。但目前連翹酯苷A確切的作用機(jī)制還不清楚，對Treg的影響也尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過探討連翹酯苷A對內(nèi)毒素血癥小鼠外周血Treg和脾臟Foxp3的影響，闡明連翹酯苷A的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為連翹防治內(nèi)毒素血癥提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性BABL/C小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量 (18±2)g，購自南昌大學(xué)動科部。連翹酯苷A(20mg，批號L28-110506)購于江西本草天工科技有限公司;LPS(Escherichia coli，026:B6)購自Sigma公司。熒光標(biāo)記抗體Anti-Mouse CD4 FITC，Anti-Mouse CD25 PE，Anti-Mouse CD3e PE-Cy5均購自美國eBioscience公司;流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品?？剐∈驝D25單克隆抗體 (PC61)購自Biolegend;兔抗Foxp3單克隆抗體購自英國Abcame公司;β-actin鼠抗單克隆抗體購自中山金橋?？俁NA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Omega公司;SYBR@Premix Ex TaqTMII熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司;StepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品;PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。紅細(xì)胞裂解液購自天根生物技術(shù)有限公司;小鼠白細(xì)胞介素 (IL)-10、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)-β1酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)檢測試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模及標(biāo)本留取 將BABL/C小鼠隨機(jī)分成正常對照組，模型對照組，抗體對照組，連翹酯苷A高、中、低3個(gè)劑量組，每組8只。正常組、模型組、抗體組腹腔注射 (Intraperitoneal injection，ip)生理鹽水0.5 mL/d，連續(xù)7 d;其中抗體組第2天腹腔注射Anti-CD251.2 mg/kg來耗竭Treg;3個(gè)藥物組分別腹腔注射連翹酯苷A 80 mg/kg、20 mg/kg、5 mg/kg，連續(xù)7 d;第8天正常對照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL，其他組均腹腔注射LPS 10 mg/kg。4 h后無菌取血，并取脾組織置液氮冷凍后-80℃保存。用流式細(xì)胞術(shù)測外周血Treg比例變化;實(shí)時(shí)PCR和Western blot法測定脾臟組織Foxp3表達(dá)。

1.2.2 一般情況觀察 觀察腹腔注射LPS后小鼠飲食飲水、排便、行為活動等，記錄小鼠死亡情況。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測Treg 流式上樣管中加入肝素鈉抗凝血100μL，加入 FITC-anti-CD4，PE-anti-CD25，PE-Cy5-anti-CD3e各5 μL，并設(shè)立同型對照管。充分震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫避光孵育10 min，然后1000 r/min離心5 min，棄去上清液。加2 mL PBS洗1次，最后加500 μL PBS重懸，應(yīng)用 BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀上機(jī)檢測。用BD FACS Diva軟件分析數(shù)據(jù)，并減去非特異性對照，以FSC/SSC和SSC/CD3+設(shè)門，檢測門內(nèi)10000個(gè)細(xì)胞中CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞與FITC標(biāo)記的CD4+細(xì)胞的比率，即為Treg百分率。

1.2.4 Real-time PCR檢測Foxp3 mRNA 取50～100 mg脾組織提取總RNA，以紫外分光光度計(jì)測定吸光度值，-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行real time PCR，引物序列如下:Foxp3正向:5-CTCATGATAGTGCCTGTGTCCTCAA-3，反向:5-AGGGCCAGCATAGGTGCAAG-3，擴(kuò)增片段93 bp;以 β-actin為內(nèi)參，正向:5-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3，反 向:5-ATGGAGCCACCGATCCACA-3，擴(kuò)增片段171 bp。反應(yīng)體系20 μL，每個(gè)樣本均重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，采用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序:預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s共40個(gè)循環(huán)，退火60℃34 s。所有擴(kuò)增產(chǎn)物用融解曲線和瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物單一性。數(shù)據(jù)由熒光定量PCR儀收集并計(jì)算CT值。CT(Threshold Cycle)值的含義:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到系統(tǒng)能夠辨認(rèn)的目的DNA合成時(shí)的循環(huán)數(shù)，cDNA含量越低，所對應(yīng)的CT值越高。采用2-ΔΔCT相對定量的方法表示Foxp3 mRNA的相對表達(dá)水平。公式如下:

ΔΔCT= (CTFoxp3-CTβ-actin) 實(shí) 驗(yàn) 組 -(CTFoxp3-CTβ-actin)正常組 (平均值)

mRNA 相對表達(dá)量 =2-ΔΔCT×100%。

1.2.5 脾臟Foxp3蛋白表達(dá)的測定 組織稱定質(zhì)量，放入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中冰浴裂解，-20℃保存。采用BCA法測蛋白濃度，通過Western印跡法進(jìn)行分析。取各待測樣品以4X上樣緩沖液煮沸5 min，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干電轉(zhuǎn)移法，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂牛仔封閉1.5 h后，經(jīng)一抗 (鼠源抗β-actin 1∶2000;兔源抗Foxp31∶1000)孵育4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (山羊抗小鼠1∶5000，山羊抗兔1∶10000)孵育4 h及ECL顯色。Bio-Rad軟件分析圖像，讀取A值，F(xiàn)oxp3蛋白的相對表達(dá)量=AFoxp3/Aβ-actin。

1.2.6 ELISA法檢測血清IL-10、TGF-β1 小鼠摘眼球取血，室溫凝固4 h，3500 r/min離心15 min，收集上清，待測。以雙抗體夾心法檢測血清IL-10、TGF-β1水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPASS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析處理。結(jié)果以表示，單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，多組間比較采用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般表現(xiàn)情況 正常對照組小鼠飲食活動正常，反應(yīng)機(jī)敏，生理狀態(tài)未見明顯改變。模型組小鼠造模后與正常組相比，精神不振，皮毛豎立無光澤，畏寒顫抖且卷縮抱團(tuán);自主活動減少嗜睡，抓取時(shí)反應(yīng)遲鈍?？贵w和藥物干預(yù)組小鼠無明顯異常變化。整體無死亡現(xiàn)象。

2.2 各組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例變化 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例顯著上升 (P＜0.01);與模型組相比，連翹酯苷A高劑量組能夠達(dá)到與抗體組相似的療效，即明顯降低小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例 (P＜0.01)，且雙陽性細(xì)胞比例隨連翹酯苷A劑量增加而相應(yīng)降低，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系 (P＜0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例的變化(%，)Tab.1 Changes of perpheral blood CD4+CD25+/CD4+T ratio in each group of mice(%，)

表1 各組小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T比例的變化(%，)Tab.1 Changes of perpheral blood CD4+CD25+/CD4+T ratio in each group of mice(%，)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與內(nèi)毒素模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05

組別 動物數(shù)/只 CD4+CD25+/CD4+T正常對照組89.8±0.72內(nèi)毒素模型組 8 37.9 ±2.10＊＊抗體組 8 11.9±0.80##連翹酯苷A高劑量組 8 12.6±1.04##連翹酯苷A中劑量組 8 21.1±1.13#連翹酯苷A低劑量組 8 30.9±1.22#

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血CD4+CD25+/CD4+T細(xì)胞比例Fig.1 Peripheral blood CD4+CD25+/CD4+T cell ratios in mice measured by flow cytometry

流式結(jié)果圖 (圖1)中，Q4象限表示CD4+T細(xì)胞，Q2象限表示CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞。由圖可見，內(nèi)毒素模型組Q2象限的雙陽性細(xì)胞比例與Q4象限的總CD4+T細(xì)胞相差不大，而正常對照組和連翹酯苷A高劑量組的Q2細(xì)胞比例明顯少于Q4。

2.3 各組小鼠脾組織Foxp3 mRNA和蛋白的表達(dá) Foxp3 mRNA在正常小鼠脾組織內(nèi)均有一定程度的表達(dá)，與正常對照組比較，模型組小鼠Foxp3 mRNA表達(dá)上調(diào)非常顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);用抗體以及連翹酯苷A干預(yù)后Foxp3 mRNA表達(dá)明顯下降且呈劑量依賴關(guān)系，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，P＜0.05);各組Foxp3蛋白的表達(dá)變化與Foxp3 mRNA相似。見表2，圖2。

表2 各組小鼠脾組織中Foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)的變化(IOD值，)Tab.2 Changes of Foxp3 mRNA and protein expression on spleen tissue in each group of mice(%，)

表2 各組小鼠脾組織中Foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)的變化(IOD值，)Tab.2 Changes of Foxp3 mRNA and protein expression on spleen tissue in each group of mice(%，)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與內(nèi)毒素模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05

Foxp3 mRNA正常對照組組別 動物數(shù)/只 Foxp3蛋白8 0.27±0.03 0.24±0.03內(nèi)毒素模型組 8 0.83 ±0.04＊＊ 0.93 ±0.05＊＊抗體組 8 0.25±0.03##0.31±0.03##連翹酯苷A高劑量組 8 0.22±0.03##0.29±0.02##連翹酯苷A中劑量組 8 0.50±0.05# 0.44±0.03#連翹酯苷A低劑量組 8 0.63±0.04# 0.73±0.03#

圖2 Western blot檢測LPS對小鼠脾組織Foxp3蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Foxp3 protein expression from LPS on spleen tissue in mice by Western blot

2.4 各組小鼠血清IL-10和TGF-β1的變化 內(nèi)毒素模型組小鼠血清IL-10水平顯著高于正常對照組(P＜0.01);抗體以及藥物干預(yù)后，能有效降低小鼠血清IL-10分泌，且隨藥物劑量降低作用減弱(P＜0.01，P＜0.05)。TGF-β1變化水平不如 IL-10明顯，與正常對照組相比，模型組表達(dá)升高 (P＜0.01);抗體和高、中劑量藥物干預(yù)后均能降低該變化 (P＜0.05);但藥物低劑量組與模型組相比，差異不顯著 (P＞0.05)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組小鼠外周血血清中IL-10及TGF-β1的水平變化(pg/mL，)Tab.3 Changes of IL-10 and TGF-β1 levels in peripheral blood serum of each group of mice(pg/mL，)

表3 各組小鼠外周血血清中IL-10及TGF-β1的水平變化(pg/mL，)Tab.3 Changes of IL-10 and TGF-β1 levels in peripheral blood serum of each group of mice(pg/mL，)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與內(nèi)毒素模型組比較，##P＜0.01，#P ＜0.05

組別 動物數(shù)/只IL-10/(pg·mL-1)TGF-β1/(pg·mL-1)1471.65±158.698 45.91±5.37 805.44±95.52內(nèi)毒素模型組 8 142.22 ±16.39＊＊ 1530.81 ±184.83＊＊抗體組 8 59.50±5.29## 872.39±90.53#連翹酯苷A高劑量組 8 51.68±7.63## 942.20±77.27#連翹酯苷A中劑量組 8 75.84±5.04# 1304.78±71.30#連翹酯苷A低劑量組 8 104.45±6.83#正常對照組

3 討論

中藥由于資源廣闊，藥性溫和，毒副作用小且較少出現(xiàn)耐藥性，而越來越受到關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中藥某些有效成分對內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的免疫調(diào)節(jié)異常作用顯著。內(nèi)毒素血癥是由于血液受到細(xì)菌或外源內(nèi)毒素污染而引起的病理生理表現(xiàn)，屬于全身性感染的一種癥狀。在內(nèi)毒素致病過程中，產(chǎn)生的各種生物學(xué)效應(yīng)引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)異常，以及產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等均參與疾病的發(fā)生［2］。Treg是一種表型與功能特異的T淋巴細(xì)胞亞群，在機(jī)體免疫平衡中起重要作用。Caramalho等［7］報(bào)道，LPS能與暴露于Treg上的TLR4受體結(jié)合，提高Treg的生存與增殖能力，并10倍增強(qiáng)Treg的免疫抑制功能。因此，本研究從Treg的免疫學(xué)角度，通過建立小鼠內(nèi)毒素血癥模型，觀察小鼠外周血Treg和脾臟Foxp3的變化等來探討受試藥物連翹酯苷A對Treg的影響。

Treg能有效預(yù)防和消除病原體感染，抑制過強(qiáng)的免疫應(yīng)答來維持機(jī)體免疫平衡，與自身免疫性疾病、移植耐受以及腫瘤免疫等方面密切相關(guān)［8］。Treg在自然狀態(tài)下表現(xiàn)免疫無能性，對IL-2等特異性抗原的刺激呈無反應(yīng)狀態(tài);Treg活化后，其免疫抑制性是抗原非特異的，能夠通過直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β1等來抑制效應(yīng)性CD4+、CD8+T細(xì)胞的生物活性［9］。本研究中通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素模型組小鼠的外周血Treg比例明顯升高 (P＜0.01)，提示小鼠感染內(nèi)毒素后，機(jī)體的免疫功能明顯受抑，可能是由于LPS引起Treg過度活化，從而抑制了CD4+、CD8+T細(xì)胞的增殖。而用連翹酯苷A干預(yù)后，小鼠外周血Treg比例明顯下降，且隨藥物劑量的增加而程度更加明顯，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系 (P＜0.05)，其中高劑量藥物組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，說明連翹酯苷A可以通過抑制Treg活化來糾正內(nèi)毒素所致的機(jī)體免疫受抑狀態(tài)。

細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1是免疫細(xì)胞功能上相互聯(lián)絡(luò)的重要因素之一，IL-10具有多功能性，能阻止抗原遞呈細(xì)胞功能或下調(diào)共刺激分子表達(dá)，以及作用于T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)其無能，使機(jī)體細(xì)胞免疫減弱。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1可作為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)器，能夠增強(qiáng)或抑制效應(yīng)T細(xì)胞增生，調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)，并能促進(jìn)外周CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性細(xì)胞，來維持免疫平衡［10］。本研究中發(fā)現(xiàn)高劑量連翹酯苷A能使Treg分泌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1明顯減少，因此連翹酯苷A減少Treg分泌抑制性細(xì)胞因子，可能是通過以上兩種機(jī)制來增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是賦予Treg細(xì)胞免疫抑制功能的主要分子，介導(dǎo)Treg的發(fā)育與表達(dá)，是其最特異的標(biāo)記分子［11］。Foxp3基因異常會導(dǎo)致Treg細(xì)胞數(shù)量及功能的變化，并影響其調(diào)控機(jī)制，最終導(dǎo)致免疫功能紊亂，因此Foxp3對機(jī)體免疫自穩(wěn)起著決定性作用。在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中約有5%～10%的細(xì)胞持續(xù)表達(dá)CD25+分子，并在CD4+CD25+分子中高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3［12-13］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過LPS刺激的模型組小鼠Foxp3的表達(dá)升高十分顯著 (P＜0.01)，連翹酯苷A干預(yù)后能明顯降低患病小鼠脾臟Foxp3的表達(dá)，提示連翹酯苷A可以通過抑制Foxp3的升高而減弱Treg的功能。

綜上所述，內(nèi)毒素可以引起全身性炎癥反應(yīng)，使機(jī)體免疫功能異常，表現(xiàn)為患病小鼠外周血Treg比例、Treg特異性標(biāo)志分子Foxp3的表達(dá)、以及抑炎因子IL-10、TGF-β1的分泌均升高。而本研究發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A作用后可有效緩解LPS所致的機(jī)體免疫功能紊亂，通過減少Treg數(shù)、IL-10和TGF-β1的分泌，以及降低Foxp3的表達(dá)水平，抑制了Treg的功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。本研究闡述了連翹酯苷A對全身內(nèi)毒素血癥小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步發(fā)揮了中藥抗感染的特色與優(yōu)勢，以期為內(nèi)毒素血癥的治療提供幫助。

［1］陳玉時(shí)，朱金華，曾 偉.細(xì)菌內(nèi)毒素及其拮抗藥物的研究概況［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(9):162-164.

［2］Simpson A，Martinez F D.The role of lipopolysaccharide in the development of atopy in humans［J］.Clin Exp Allergy，2010，40(2):209-223.

［3］Agata K，Lidia C，Stanis?aw P，et al.The significance of Treg cells in defective tumor immunity［J］.Arch Immunol Ther Exp，2008，56(3):181-191.

［4］劉文博，李德朋，張桂林，等.連翹酯苷藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(7):236-238.

［5］韓雙紅，王玉芬，張居馨.連翹敗毒片的抗內(nèi)毒素及免疫調(diào)節(jié)作用的研究［J］.天津中醫(yī)藥，2004，21(5):417-419.

［6］傅 強(qiáng)，崔華雷，崔乃杰.連翹提取物抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津醫(yī)藥，2003，31(3):161-163.

［7］Caramalho I，Lopes C T，Ostler D，et al.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide［J］.J Exp Med，2003，197(4):403-411.

［8］Lu L，Zhang F，Wang X H，et al.Isolation and function analysis of rat CD4+CD25+regulatory T cell［J］.Chin J Cell Mol Immunol，2006，22(4):417-419.

［9］Khazaie K，Von B H.The impact of CD4+CD25+Treg on tumor specific CD8+T cell cylotoxicity and cancer［J］.Semin Cancer Bio，2006，16(2):124-136.

［10］Koichi K ，Anil P，Bernhard J H，et al.Transforming growth factor beta 1(TGF-β1)and rapamycin synergize to effectively suppress human T cell responses via upregulation of FoxP3+Tregs［J］.Transpl Immunol，2010，23(1/2):28-33.

［11］Lal G，Zhang N，Vander T W，et al.Epigenetic regulation of Foxp3 expression in regulatory T cells by DNA methylation［J］.J Immunol，2009，182(1):259-273.

［12］Pillemer B B，Xu H，Oriss T B，et al.Deficient SOCS3 expression in CD4+CD25+Foxp3 regulatory T cells and SOCS3-mediated suppression of Treg function［J］.Eur J Immunol，2007，37(8)2082-2089.

［13］Larkin J，Rankin A L，Picca C C，et al.CD4+CD25+regulatory T cell repertoive formation shaped by differential presentation of peptides from a self-antigen［J］.J Immunol，2008，180(4):2149-2157.