沈 慧， 尹雅玲， 李超堃， 趙紅崗， 馬 潔， 李東亮△

長(zhǎng)期以來(lái)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)一直被為是細(xì)胞能量供應(yīng)和利用的物質(zhì)形式，在線粒體產(chǎn)生，進(jìn)入細(xì)胞漿(約5～10 mmol/L)發(fā)揮作用［1］。但近年來(lái)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，胞外高濃度ATP是一種細(xì)胞死亡因子［2］，文獻(xiàn)指出低濃度ATP短暫作用于P2X7受體，僅僅形成允許陽(yáng)離子透過(guò)的通道;而高濃度ATP，反復(fù)持久作用于P2X7受體，形成允許各種陽(yáng)離子和900 D以下的有機(jī)物質(zhì)通過(guò)的“膜孔”［3-4］。膜的通透性隨著ATP濃度和作用時(shí)間的增加發(fā)生了質(zhì)的變化，低于900 D的分子和離子均可通透，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，空泡形成、凋亡和壞死［5］。

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)的誘導(dǎo)下分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞，是當(dāng)前廣泛用于研究神經(jīng)細(xì)胞功能、分化和凋亡的一種細(xì)胞系［6］，但胞外高濃度ATP對(duì)PC12細(xì)胞的影響及其機(jī)制卻罕有研究報(bào)道。本文將探討高濃度ATP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞膜孔形成及關(guān)鍵蛋白，為以后神經(jīng)保護(hù)的研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone);不含酚紅Hanks緩沖液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);ATP、亮藍(lán)G(brilliant blue G，BBG)和生胃酮(carbenoxolone，CBX)(Sigma);P2X7受體抗體和pannexin 1(Panx1)抗體(Abcam);YOPRO-1 Iodide(Invitrogen);GAPDH、P2X7受體和Panx1引物及PCR試劑盒(Vazyme);蛋白印跡試劑盒(中國(guó)碧云天公司);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞系 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(高分化)來(lái)自上海中科院典型細(xì)胞培養(yǎng)庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞置于內(nèi)含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好及誘導(dǎo)分化均一的細(xì)胞懸液接種于96孔板中培養(yǎng)，YO-PRO-1攝取實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度約1×109cells/L，CKK-8實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度約1×108cells/L。接種24 h后隨機(jī)分組，每組3個(gè)復(fù)孔。本實(shí)驗(yàn)分組為:0 mmol/L ATP組、1 mmol/L ATP組、3 mmol/L ATP組、5 mmol/L ATP組、BBG組、CBX組、BBG預(yù)孵育組和CBX預(yù)孵育組。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 把PC12細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)按實(shí)驗(yàn)分組要求給予不同的處理因素作用一定時(shí)間后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 把PC12細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)按實(shí)驗(yàn)分組要求給以不同的處理因素，作用一定時(shí)間后，CCK-8檢測(cè)時(shí)每孔加入預(yù)溫37℃的10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(A)，計(jì)算公式如下:細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A×100%。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組細(xì)胞存活率定為100%。

2.4 YO-PRO-1攝入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膜孔形成［7］YOPRO-1是一種對(duì)正常細(xì)胞不滲透的陽(yáng)離子熒光染料(分子量629 D)。細(xì)胞膜孔形成時(shí)YO-PRO-1可進(jìn)入細(xì)胞與核酸結(jié)合發(fā)出綠光。用含ATP和YO-PRO-1的溶液加入各組細(xì)胞中，并使ATP終濃度為相應(yīng)濃度，YO-PRO-1終濃度為2 μmol/L，37 ℃孵育1 h，而后在熒光顯微鏡下觀察或用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)516 nm)。YO-PRO-1熒光強(qiáng)度(%)=實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A×100%。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組細(xì)胞攝取的熒光強(qiáng)度定為100%。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)P2X7受體和Panx1 mRNA的表達(dá) 用0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞后提取細(xì)胞總RNA，測(cè)260和280 nm處的A值，A260/A280比值為2.0左右。RNA瓊脂糖凝膠電泳28S、18S和5S條帶清晰可見(jiàn)，表明抽提的RNA較完整，未見(jiàn)明顯降解。提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，并以合成的cDNA為模板，以P2X7受體和Panx1引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)條件:95℃ 10 min;95℃ 10 s，60 ℃ 30 s，50 個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 600 s，95 ℃ 10 s，結(jié)束擴(kuò)增。

2.6 Western blotting檢測(cè)P2X7受體和Panx1蛋白的表達(dá) 用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞裂解液160 μL裂解細(xì)胞，收集總蛋白經(jīng)10%SDSPAGE分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜膜上;5%脫脂牛奶(TBST 配制，TBST:20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween20，pH 7.4)，室溫封閉2 h;加入兔抗大鼠P2X7受體抗體(1∶2 500稀釋)或兔抗大鼠Panx1抗體(1∶1 000稀釋)，4℃搖床過(guò)夜;加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 500稀釋)，室溫作用1 h;ECL顯色，X光片曝光并記錄結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)中以GAPDH為內(nèi)參照蛋白。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ATP對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

ATP作用3 h后倒置相差顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)的變化發(fā)現(xiàn)，隨著ATP濃度的增加，細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形，體積皺縮，折光性減弱，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，脫壁細(xì)胞增加，見(jiàn)圖1。這表明ATP對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用有濃度依賴性。

Figure 1.The effect of different concentrations of ATP on the morphological changes of PC12 cells.A:control;B:ATP(1 mmol/L);C:ATP(3 mmol/L);D:ATP(5 mmol/L).圖1 不同濃度ATP對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，以空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，則1 mmol/L、3 mmol/L和5 mmol/L ATP組存活率分別為100.94%、87.29%和71.96%，其中3 mmol/L和5 mmol/L ATP顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著ATP濃度的增加，細(xì)胞存活率降低呈劑量依賴性趨勢(shì)，見(jiàn)圖2A。由圖2B中可知，5 mmol/L ATP作用2 h組細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05)，3 h組差異更顯著(P＜0.01)，表明細(xì)胞存活率在 ATP作用3 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而細(xì)胞活力逐漸下降。

2 ATP介導(dǎo)PC12細(xì)胞的膜孔形成

Figure 2.The effect of different concentrations of ATP(A)or 5 mmol/L ATP for different time periods(B)on the viability of the PC12 cells.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control group(0 mmol/L or 0 h).圖2 不同濃度ATP對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

熒光物質(zhì)YO-PRO-1攝入作為膜孔形成的指標(biāo)，在熒光顯微鏡下觀察不同濃度ATP對(duì)細(xì)胞攝入YOPRO-1的影響。0、1、3和5 mmol/L ATP作用PC12細(xì)胞15、30和60 min發(fā)現(xiàn)，同一濃度的ATP作用，隨著時(shí)間的增加胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增加;同一作用時(shí)間，則隨著ATP濃度的升高，胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度亦增加，表明PC12細(xì)胞膜孔激活與施加的ATP濃度和作用時(shí)間都有依賴性，見(jiàn)圖3A。0 mmol/L、1 mmol/L、3 mmol/L和5 mmol/L ATP刺激 PC12細(xì)胞后1 h，YO-PRO-1的熒光強(qiáng)度分別是 1.00 ±0.04、1.08 ±0.04、1.11 ±0.07 和1.15 ±0.06。其中3 mmol/L 和5 mmol/L ATP處理組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度均明顯高于對(duì)照組細(xì)胞(P ＜0.05)，見(jiàn)圖3B。

3 ATP對(duì)P2X7受體和Panx1 mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，1 mmol/L ATP對(duì)細(xì)胞的P2X7受體mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯影響(P ＞0.05)，3 mmol/L和5 mmol/L ATP組 P2X7受體mRNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)。但各濃度ATP作用PC12細(xì)胞后，Panx1 mRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著變化(P ＞0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The effect of extracellular ATP on uptake of YO-PRO-1 in the PC12 cells.A:the cells were imaged at different time points;B:the cells were quantified with plate-reader assay at 60 min.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 mmol/L.圖3 不同濃度ATP對(duì)YO-PRO-1攝入的影響

4 ATP對(duì)P2X7受體和Panx1蛋白的表達(dá)

蛋白印跡結(jié)果表明，1 mmol/L ATP作用3 h后P2X7受體蛋白的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，3 mmol/L和5 mmol/L ATP組的P2X7受體蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)。但不同濃度ATP作用PC12細(xì)胞后，Panx1蛋白表達(dá)均未見(jiàn)顯著變化(P ＞0.05)，見(jiàn)圖 5。

5 BBG和CBX對(duì)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，以空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%。BBG、CBX、BBG+CBX和YOPRO-1處理細(xì)胞，細(xì)胞活性與對(duì)照組比均無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖6A。ATP(5 mmol/L)組的細(xì)胞活性則明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，BBG預(yù)孵育后再用ATP處理，則細(xì)胞活性明顯高于ATP組(P＜0.01)，CBX預(yù)孵育則未見(jiàn)阻斷 ATP效應(yīng)(P＞0.05)，見(jiàn)圖6B。BBG+CBX同時(shí)預(yù)孵育與BBG預(yù)孵育的細(xì)胞活性也明顯高于ATP組，與單用BBG預(yù)孵育組的結(jié)果無(wú)明顯差異，表明BBG+CBX并未進(jìn)一步增強(qiáng)BBG對(duì)ATP的阻斷效應(yīng)。

Figure 4.The effect of different concentrations of ATP on the mRNA expression of P2X7receptor and Panx1 in the cultured PC12 cells.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜ 0.01 vs 0 mmol/L.圖4 ATP對(duì)P2X7受體和Panx1 mRNA表達(dá)的影響

6B BGCBXATP

和對(duì)介導(dǎo)的膜孔形成的影響

BBG或CBX處理細(xì)胞，攝入YO-PRO-1的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比均無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖7A。ATP(5 mmol/L)組的熒光強(qiáng)度則明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，BBG預(yù)孵育后再用ATP處理，則熒光強(qiáng)度明顯低于ATP組(P＜0.01)，CBX預(yù)孵育則未見(jiàn)阻斷ATP效應(yīng)(P＞0.05)，見(jiàn)圖7B。BBG+CBX同時(shí)預(yù)孵育與BBG預(yù)孵育的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異，表明BBG+CBX并未進(jìn)一步增強(qiáng)BBG對(duì)ATP的阻斷效應(yīng)。

Figure 5.The effect of ATP on the protein expression of P2X7receptor(A)and Panx1(B)in the cultured PC12 cells.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 mmol/L.圖5 ATP對(duì)P2X7受體和Panx1蛋白表達(dá)的影響

Figure 6.The effects of BBG，CBX and YO-PRO-1 on the viability of PC12 cells induced by ATP(B)or not(A).Mean ±SD.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control no treatment;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ATP alone.圖6 BBG和CBX對(duì)ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響

討 論

Figure 7.The effects of BBG and CBX on the YO-PRO-1 uptakeof PC12 cells induced by ATP(B)or not(A).Mean± SD.n=3.＊＊P ＜ 0.01 vs control(no treatment);##P ＜0.01 vs ATP alone;△△P ＜0.01 vs CBX+ATP.圖7BBG和CBX對(duì)胞外高濃度ATP誘導(dǎo)細(xì)胞攝入YOPRO-1的影響

近年來(lái)越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞損傷或死亡時(shí)大量ATP釋放到胞外。腦外傷后損傷周?chē)鷧^(qū)ATP濃度、P2X7受體表達(dá)上調(diào)，繼而引起神經(jīng)元繼發(fā)性損傷。在體腦缺氧缺血或離體糖氧剝奪模型都觀察到細(xì)胞外ATP明顯升高，F(xiàn)ranke等［8］將大腦皮質(zhì)腦片在低氧條件(95%N2、5%CO2)下培養(yǎng)30 min就可引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，若用ATP-P2X7受體阻斷劑磷酸吡哆醛預(yù)處理，則可阻止細(xì)胞死亡，表明ATP-P2受體在缺氧缺血腦損傷中有重要作用。新近美國(guó)生理學(xué)雜志“編輯聚焦”欄目發(fā)表評(píng)論文章［2］指出:越來(lái)越多的證據(jù)提示“ATP是一種死亡因子”，“P2X7受體是凋亡和壞死的主要介導(dǎo)者”。

PC12細(xì)胞常常用作研究缺氧缺血神經(jīng)元的模型細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)積累了較多的經(jīng)驗(yàn)［9］。P2X7受體在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)有較多的報(bào)道［10］，但神經(jīng)元表達(dá)P2X7受體則研究較少［11］，PC12細(xì)胞是否分布有P2X7受體尚需更多證據(jù)［12］。本文結(jié)果表明PC12細(xì)胞表達(dá)有一定量的P2X7受體mRNA和蛋白。這一結(jié)果與近期南昌大學(xué)的報(bào)道相符合［12］，為PC12細(xì)胞用于研究ATP的毒性效應(yīng)及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

在許多組織和細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中觀察到，P2X7受體長(zhǎng)時(shí)間或高濃度激動(dòng)劑激活后可形成膜孔，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放，這種特性與多種炎癥性疾病密切相關(guān)［13］。本文以熒光物質(zhì)YO-PRO-1攝入為指標(biāo)，觀察到ATP誘導(dǎo)了PC12細(xì)胞的膜孔形成。發(fā)現(xiàn)隨著3 mmol/L ATP作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞攝取YO-PRO-1增加，明顯高于對(duì)照組，具有時(shí)間依賴性。隨著胞外ATP濃度的升高，細(xì)胞攝取YO-PRO-1也逐漸增加，具有濃度依賴性。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性的結(jié)果顯示，隨著胞外ATP濃度增高，細(xì)胞存活率降低，呈劑量依賴性，與YO-PRO-1攝入實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符合，彼此印證了外源性ATP高劑量、長(zhǎng)時(shí)程作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞越來(lái)越嚴(yán)重的損傷。

目前有學(xué)者認(rèn)為P2X7受體-Panx1復(fù)合物是膜孔形成的基礎(chǔ)［14］。研究發(fā)現(xiàn)急性分離的海馬錐體神經(jīng)元在氧和葡萄糖剝奪(oxygen and glucose deprivation，OGD)早期，打開(kāi)一種大電導(dǎo)通道，該通道開(kāi)放時(shí)其電導(dǎo)高達(dá)550 pS，允許大分子染料指示劑calcein和SR101通過(guò)，且可被半通道抑制劑CBX阻斷。根據(jù)其電生理特點(diǎn)可以判斷其為縫隙連接半通道，并推測(cè)這種通道由Panx1組成［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，P2X受體長(zhǎng)時(shí)間被高濃度ATP激活(其中P2X7受體最為顯著)可允許低于900 D的分子和離子通過(guò)，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、空泡形成、凋亡和壞死［5］。該現(xiàn)象一直未得以解釋。也有文獻(xiàn)報(bào)道，P2X7受體通道的某些性質(zhì)與連接蛋白Panx1相似［16］。有較多研究顯示，P2X7受體與Panx1是偶聯(lián)的。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ATP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用存在雙重性:既能夠促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，也能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或死亡［17］。那么胞外高濃度的ATP長(zhǎng)時(shí)間作用細(xì)胞，損傷細(xì)胞，是否影響了細(xì)胞膜通透性，如果影響了，那么主要由P2X7受體介導(dǎo)，還是主要由Panx1介導(dǎo)呢?本文用BBG或CBX預(yù)孵育處理后，發(fā)現(xiàn)BBG預(yù)孵育組可以有效減少YO-PRO-1的攝入，CBX預(yù)孵育組沒(méi)有明顯阻斷效應(yīng)，且BBG預(yù)孵育組與BBG+CBX共同預(yù)孵育組沒(méi)有明顯差異，提示ATP引起的細(xì)胞通透性的改變可能主要與P2X7R激活有關(guān)，與細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。進(jìn)一步通過(guò)real-time PCR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)P2X7受體和Panx1 mRNA和蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著ATP的濃度增加，P2X7受體的表達(dá)逐漸增加，具有濃度依賴性，但Panx1的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與P2X7受體的表達(dá)上調(diào)相一致。根據(jù)上述結(jié)果，我們?cè)O(shè)想ATP與P2X7受體作用后可能通過(guò)調(diào)節(jié)Panx1蛋白形成膜孔，大量胞內(nèi)溶質(zhì)透出而引起細(xì)胞死亡。

綜上所述，胞外高濃度ATP可使PC12細(xì)胞形成膜孔，增加細(xì)胞通透性，造成細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞活力。ATP引起PC12細(xì)胞膜孔形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)是P2X7受體蛋白，而Panx1半通道蛋白在膜孔形成中的作用及其與P2X7受體之間的關(guān)系，ATP上調(diào)P2X7受體后，如何激活Panx1所涉及的具體細(xì)節(jié)尚需更多的研究予以證實(shí)。

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