馬迎春， 鄭夢曉， 黃林靜， 王園園， 應(yīng) 磊，2， 王萬鐵，2△

研究表明，慢性缺氧可降低肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)胞膜上電壓依賴性鉀離子通道(voltage-dependent K+channel，Kv)的活性，同時還可直接調(diào)控 Kv通道基因的變化進(jìn)而引起PASMCs的收縮和增殖;除此之外，胞質(zhì)中充足的鉀離子還可以抑制PASMCs的凋亡［1］。PASMCs上 Kv通道功能失調(diào)，尤其是Kv1.5的表達(dá)下調(diào)及功能障礙，已成為肺動脈高壓的基本特征之一［2-3］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路是各種信號通路的匯集點，對其它信號通路有重要調(diào)控作用，在應(yīng)激、創(chuàng)傷、炎癥和休克等疾病的發(fā)生過程中起一定的作用。該通路的激活可能參與肺動脈高壓的發(fā)生且研究發(fā)現(xiàn)［4］。因此有關(guān)低氧和MAPK信號通路之間的關(guān)系也漸漸成為研究的熱點。而實際情況中低氧一般都伴隨有高二氧化碳的潴留，故在實驗中我們選擇復(fù)制低氧高二氧化碳模型。本實驗將采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，Western blotting檢測鉀離子通道 Kv1.5、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)及Bax蛋白的表達(dá)水平，以此來研究低氧高二氧化碳條件下 Kv1.5對離體大鼠PASMCs增殖、凋亡的影響，同時探討這些變化與MAPK通路之間的關(guān)系。

材料和方法

1 動物和主要試劑

SPF級健康雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，體重(220±20)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［SCXK(浙)2010-0044號］。

SB203580、U0126、茴香霉素(anisomycin)、Kv1.5兔抗鼠多克隆抗體、Ⅰ型膠原酶、木瓜蛋白酶和牛血清白蛋白(Sigma);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和胰酶/EDTA(Gibco);小鼠 α-平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(Abcam);FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgGⅡ抗(武漢博士德公司);HRP標(biāo)記的小鼠單克隆β-actin(上?？党晒?;PCNA兔抗鼠多克隆抗體(Bioworld);Bax兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz);Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(同仁化學(xué));二硫蘇糖醇(Merck)。

2 大鼠PASMCs的培養(yǎng)鑒定及實驗分組

常規(guī)麻醉大鼠后用75%乙醇消毒，于超凈臺內(nèi)迅速取出心肺組織，在解剖顯微鏡下分離獲得3～4級肺動脈(直徑300～700 μm)，輕微剝除外膜及去除內(nèi)皮細(xì)胞后將平滑肌剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊。加入消化酶于37℃消化15 min，吸出消化酶加入含血清的DMEM終止消化，玻璃滴管將其輕輕吹打成細(xì)胞懸液，靜止3 min，待未被消化的組織塊沉淀后吸出細(xì)胞懸液于另一離心管中。余組織塊繼續(xù)加入消化酶37℃消化5 min后加入培養(yǎng)液終止消化，吹打成細(xì)胞懸液，如此反復(fù)2～3次即可將組織塊完全消化成單個PASMCs。收集PASMCs種植于培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d后細(xì)胞已經(jīng)貼壁并長成長梭形，并呈“峰-谷”狀生長，如培養(yǎng)液呈黃色可給予換液，1周左右區(qū)域細(xì)胞已融合生長，即可傳代。細(xì)胞傳至3代后，按傳代方法消化，吹打細(xì)胞，然后使細(xì)胞在第1瓶中貼壁15 min，光鏡下可見部分細(xì)胞貼壁;后將第1瓶中培養(yǎng)基移入第2瓶中，使細(xì)胞再次貼壁15 min，光鏡下又可見大部分細(xì)胞貼壁;最后再將第2瓶中培養(yǎng)基移入第3瓶中，再使細(xì)胞貼壁，后將3瓶均補(bǔ)齊培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d后，光鏡下觀察，第1瓶中以較大長梭形細(xì)胞為主，為成纖維細(xì)胞;第2瓶為混合細(xì)胞;第3瓶中為較純的梭形平滑肌細(xì)胞;取第3瓶細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。也可重復(fù)純化幾次;獲得較純的平滑肌細(xì)胞。體外培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞用激光共聚焦免疫熒光染色法鑒定，具體方法參考本室黎關(guān)龍等［5］先前的報道。

選第3～5代生長良好的對數(shù)生長期PASMCs，將其消化制成細(xì)胞懸液，按2×108cells/L的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿及按1×108cells/L的密度接種于96孔板(100 μL)，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待融合成單層細(xì)胞(80% ～90%)時換成無血清培養(yǎng)基饑餓24 h使細(xì)胞周期同步化然后行分組。(1)正常(normal，N)組:5%CO2、21%O2、37 ℃;(2)低氧高二氧化碳(hypoxia+hypercapnia，HH)組:6%CO2、4%O2、37℃;(3)DMSO 對照(hypoxia+hypercapnia+DMSO，HD)組:0.05%DMSO、6%CO2、4%O2、37 ℃;(4)U0126(hypoxia+hypercapnia+U0126，HU)組:10 μmol/L U0126、6%CO2、4%O2、37℃;(5)SB203580(hypoxia+hypercapnia+SB203580，HS)組:10 μmol/L SB203580、6%CO2、4%O2、37℃;(6)茴香霉素(hypoxia+hypercapnia+anisomycin，HA)組:10 μmol/L 茴香霉素、6%CO2、4%O2、37℃。以上每組5皿細(xì)胞，96孔板每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。

3 方法

3.1 CCK-8法測定各組PASMCs的活性 造模結(jié)束后用PBS洗滌2遍，吸干水后每孔加入110 μL的培養(yǎng)基(100 μL DMEM+10 μL CCK-8 溶液，避光操作)，用錫箔紙包好后放入培養(yǎng)箱中孵育合適時間后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測其吸光度(A)值(可選取0.5 h、1 h、2 h 和4 h 幾個時點檢測)，A 值表示細(xì)胞相對活性。

3.2 Western blotting 法檢測各組 PASMCs Kv1.5、PCNA和Bax蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白并用BCA法測定蛋白濃度，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。取稀釋的兔抗鼠Kv1.5多克隆抗體(1∶400)、兔抗鼠 PCNA多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠 Bax多克隆抗體(1∶1 000)或內(nèi)參照β-actin(1∶10 000)，4℃靜置孵育過夜。次日用TBST洗膜后加HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶40 000)，室溫孵育1 h。洗膜后采用ECL化學(xué)發(fā)光法獲得目的條帶。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析Kv1.5、PCNA、Bax及 β-actin 灰度值，以目的蛋白Kv1.5、PCNA、Bax條帶灰度值和 β-actin條帶灰度值的比值代表Kv1.5、PCNA和Bax蛋白表達(dá)的相對含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 激光共聚焦免疫熒光法鑒定PASMCs

原代培養(yǎng)的PASMCs呈典型的“峰-谷”狀生長。鏡下顯示細(xì)胞呈梭形，具有長短不等的數(shù)個突起，彼此融合，邊界不清，折光性好，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈卵圓形，見圖1。培養(yǎng)至第3～5代的細(xì)胞經(jīng)小鼠α-SMA單克隆抗體孵育、FITC標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗孵育、PI染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，約99%呈陽性反應(yīng)，即高倍鏡下可見胞漿內(nèi)大量發(fā)綠色熒光、與細(xì)胞長軸平行的纖維細(xì)絲，此為α-SMA;核卵圓形居中，呈紅色，見圖2。

Figure 1.Primary culture of rat PASMCs(×100).圖1 大鼠原代培養(yǎng)肺動脈平滑肌細(xì)胞

Figure 2.Immunofluorescence identification of rat PASMCs(×600).圖2 激光共聚焦免疫熒光法鑒定平滑肌細(xì)胞

2 各組PASMCs的活性變化

與N組相比，HH組、HD組細(xì)胞活性明顯增加(P＜0.01)，HH組和 HD組間無顯著差異(P＞0.05);較之HD組，HU組、HS組及HA組細(xì)胞活性均明顯降低，且以HA組細(xì)胞活性降低最顯著(P＜0.05 和 P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3. Changes of cell viability in all groups.N:normal group;HH:hypoxia+hypercapnia group;HD:hypoxia+hypercapnia+DMSO incubation group;HU:hypoxia+hypercapnia +U0126 incubation group;HS:hypoxia+hypercapnia+SB203580 incubation group;HA:hypoxia+hypercapnia+nisomycin.Mean±SD.n=6.＊＊ P ＜ 0.01 vs N group;#P ＜ 0.05，##P ＜0.01 vs HD group.圖3 各組細(xì)胞活性比較

3 各組PASMCs上相關(guān)蛋白的表達(dá)

3.1 各組PASMCs上Kv1.5蛋白的表達(dá) 與N組相比，HH組和HD組Kv1.5蛋白表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)，HH 組和 HD 組間無差異(P ＞0.05);較之HD組，HU組、HS組及HA組Kv1.5蛋白表達(dá)明顯上升(P＜0.01)，且以HA組上升最明顯，見圖4。

Figure 4.Change of Kv1.5 protein expression in the PASMCs with different treatments.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs N group;##P ＜0.01 vs HD group.圖4 各組Kv1.5蛋白的表達(dá)

3.2 各組PASMCs上PCNA蛋白的表達(dá) 與N組相比，HH組和HD組PCNA蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.01)，HH組和HD組間無顯著差異(P＞0.05);較之HD組，HU組、HS組及HA組PCNA蛋白表達(dá)明顯均明顯下調(diào)(P＜0.01)，且以HA組下降最明顯，見圖5。

Figure 5.Change of PCNA protein expression in the PASMCs with different treatments.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs N group;##P ＜0.01 vs HD group.圖5 各組PCNA蛋白的表達(dá)

3.3 各組PASMCs上Bax蛋白的表達(dá) 與N組相比，HH組和HD組Bax蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01)，HH組和HD組間無顯著差異(P＞0.05);較之HD組，HU組、HS組及HA組Bax蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.01)，且以HA組升高最明顯，見圖6。

Figure 6.Change of Bax protein expression in the PASMCs with different treatments.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜ 0.01 vs N group;##P ＜0.01 vs HD group.圖6 各組Bax蛋白的表達(dá)

討 論

有研究表明，肺血管重構(gòu)較低氧性肺血管收縮在肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著更為重要的作用，血管結(jié)構(gòu)的重建主要表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞的肥大、增生和結(jié)締組織含量的變化［6］。生理情況下PASMCs存在有序的增殖與凋亡，二者保持平衡。低氧可刺激肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等合成分泌多種細(xì)胞因子作用于PASMCs，使其增殖。PCNA是DNA多聚酶δ的輔酶，通常在細(xì)胞周期的G1末期DNA合成開始前才表達(dá)增加，在S期達(dá)高峰，是一個比較敏感的細(xì)胞增殖指標(biāo)。有研究表明［7］在常氧條件下，PCNA在主動脈、肺動脈主干及肺內(nèi)小動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)均有微弱表達(dá);但在缺氧時只有肺小動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，支持肺內(nèi)小動脈平滑肌細(xì)胞對缺氧更為敏感的結(jié)論。另外有研究表明，Bcl-2家族的成員Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。因此在實驗中我們分別檢測各組細(xì)胞PCNA及Bax蛋白的表達(dá)情況作為反映細(xì)胞增殖、凋亡情況的指標(biāo)。

鉀離子通道在PASMCs分布廣泛且種類繁多復(fù)雜，因其平衡電位與靜息膜電位相似，而成為靜息膜電位的主要維持因素。一直以來，Kv被認(rèn)為是與低氧性肺血管收縮發(fā)生機(jī)制關(guān)系最大的鉀離子通道:低氧抑制Kv，引起細(xì)胞膜的去極化增強(qiáng)，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流增多，從而導(dǎo)致PASMCs收縮，進(jìn)一步引起肺動脈的收縮，平滑肌細(xì)胞增殖，肺血管重構(gòu)。研究表明，Kv主要通過2個方面來增加肺血管阻力［9-10］:(1)Kv通道表達(dá)密度改變導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，激活電壓依賴性鈣離子通道(voltage-dependent calcium channel，VDCC)，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞后結(jié)合肌球蛋白輕鏈激酶使興奮收縮偶聯(lián)增強(qiáng)，從而引起PASMCs收縮和肺血管收縮，最終導(dǎo)致肺血管阻力增加，并且VDCC活性增加可抑制Kv通道并且使細(xì)胞膜處于持續(xù)去極化狀態(tài)，從而引起PASMCs增殖速度的加快，進(jìn)而導(dǎo)致肺血管肥厚;(2)Kv通道有關(guān)亞基表達(dá)的下調(diào)及全細(xì)胞鉀電流的抑制將抑制細(xì)胞凋亡，引起肺血管肥厚，從而最終引起肺動脈高壓的發(fā)生。其中Kv1.5被認(rèn)為是重要的Kv通道亞型之一［11］，其產(chǎn)生的電流是細(xì)胞膜電位去極化電流的主要成分之一，長期缺氧可導(dǎo)致包括Kv1.5在內(nèi)的氧敏感鉀離子通道受損，肺血管長期收縮引起肺動脈高壓的發(fā)生。有報道稱，低氧明顯抑制Kv1.5通道活性和表達(dá)，隨低氧時間長短不一致，其下降程度不相同，并且常壓條件下，離體培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞在低氧的環(huán)境中時間越長，Kv1.5 mRNA及蛋白表達(dá)下降越明顯［12-13］，表明 Kv1.5在肺血管重構(gòu)導(dǎo)致的肺動脈高壓中起重要作用。另外有研究表明Kv1.5的基因轉(zhuǎn)移能有效降低肺動脈高壓［2］。本研究結(jié)果也顯示，慢性低氧高二氧化碳可以明顯降低PASMCs上Kv1.5蛋白表達(dá)水平，這與已有的研究結(jié)果相一致。這進(jìn)一步說明低氧高二氧化碳可能通過降低Kv1.5通道的表達(dá)引起肺動脈高壓的形成。

MAPK信號通路是一條細(xì)胞外信號引發(fā)細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的重要途徑，在細(xì)胞形成、分化、生長、增殖及凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［14］。目前發(fā)現(xiàn)MAPK家族有4條信號通路:即細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun N 端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38 絲裂原活化蛋白激 酶 (p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和 ERK5/BMKl通路。目前很多研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞增殖、血管重構(gòu)之間的關(guān)系相當(dāng)密切，并認(rèn)為MAPK可能成為血管重構(gòu)的治療靶點［4］。以往有研究表明［5］ERK1/2 及 p38 MAPK通路的激活參與了肺動脈高壓的形成。而目前尚未見p38 MAPK及ERK1/2對低氧高二氧化碳條件下大鼠PASMC上Kv1.5表達(dá)變化及對PASMCs增殖、凋亡影響的詳細(xì)報道。

實驗中我們在低氧高二氧化碳條件下分別用p38 MAPK抑制劑-SB203580、ERK1/2抑制劑-U0126及MAPK激動劑-茴香霉素處理 PASMCs，檢測 Kv 1.5、PCNA及Bax的表達(dá)情況，以此來探討MAPK對低氧高二氧化碳條件下大鼠PASMCs上Kv1.5表達(dá)變化的影響及與PASMCs增殖、凋亡的關(guān)系。本實驗發(fā)現(xiàn)，低氧高二氧化碳時PASMCs上 Kv1.5蛋白、Bax蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞活性、PCNA蛋白表達(dá)上調(diào)，而p38 MAPK通路抑制劑-SB203580能夠明顯逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象;ERK1/2通路特異阻斷劑-U0126與SB203580有相似的作用。這說明低氧高二氧化碳可能是通過激活p38 MAPK通路和ERK1/2通路引起PASMCs Kv1.5表達(dá)降低，從而導(dǎo)致鉀離子外流減少，細(xì)胞膜去極化，鈣離子內(nèi)流增加，從而導(dǎo)致PASMCs收縮和增殖加強(qiáng)，凋亡延緩。另外，低氧高二氧化碳性PASMCs給予MAPK通路激活劑-茴香霉素可導(dǎo)致Kv1.5蛋白、Bax蛋白表達(dá)繼續(xù)升高，同時也明顯高于HU組或HS組;而細(xì)胞活性、蛋白PCNA表達(dá)繼續(xù)下降，低于HU組及HS組。推測可能是由于在此種低氧高二氧化碳性條件下茴香霉素主要激活了MAPK通路中負(fù)責(zé)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的亞族及亞基，如JNK通路或p38 MAPK中的某一亞基，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。

本研究的結(jié)果顯示SB203580和U0126對低氧高二氧化碳條件下各組細(xì)胞活性，Kv1.5、PCNA及Bax蛋白表達(dá)的影響是相似的，說明p38 MAPK通路和ERK1/2通路在低氧高二氧化碳性肺動脈高壓中的作用可能相似，這與已有的大部分研究結(jié)果是一致的。但有學(xué)者認(rèn)為［15］ERKl/2通路和p38 MAPK通路之間可能存在相互制約關(guān)系，抑制p38 MAPK通路可加強(qiáng)ERK1/2的激活，導(dǎo)致凋亡延遲。也有人認(rèn)為ERK1/2和p38 MAPK通路之間存在著平衡和精確的調(diào)節(jié)，而這種相互作用是影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和死亡的重要調(diào)控機(jī)制。另有研究表明，ERK1/2通路還可拮抗JNK和p38 MAPK通路的促細(xì)胞凋亡活性，促進(jìn)細(xì)胞的生存［16］，并且ERK1/2通路激活可誘導(dǎo)MKP(mitogen-activated protein kinase phosphatase)表達(dá)增強(qiáng)，從而抑制p38 MAPK的過度激活［17］。另外MAPK與其它信號通路間也存在著復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，也許是通過PKC、PKA、Raf-MEK-ERK1/2等多種途徑共同影響低氧高二氧化碳性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展。這是一個相當(dāng)復(fù)雜精密的調(diào)控系統(tǒng)，其中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

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