方 勇， 王章桂， 侯 琦， 盧 瑜

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江杭州310016;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所，北京100050;3南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院，浙江杭州310007)

從多種中藥成份中提取出的寡聚二苯乙烯類(lèi)化合物(oligostilbenes)具有多種生物學(xué)活性，尤其是抗腫瘤活性正引起眾多研究者的關(guān)注［3-4］。我們的前期研究證實(shí)，從植物買(mǎi)麻藤中提取分離的中藥單體成分異丹葉大黃素(isorhapontigenin，ISO)可有效抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，并可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)水平，誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞遷移［5］。鑒于ISO下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平的分子機(jī)制尚不明確，本研究進(jìn)一步深入地研究其分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

1 材料

ISO由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所侯琦教授提供，分子量為258 D［5］。ISO被溶解在DMSO，儲(chǔ)存終濃度為10 mmol/L。并進(jìn)一步用DMSO稀釋?zhuān)詈驞MSO終濃度為0.1%(V/V)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。相同濃度的DMSO(0.1%，V/V)被用來(lái)作為陰性對(duì)照。

抗細(xì)胞周期蛋白D1和Sp1(specificity protein 1)抗體購(gòu)自Santa Cruz。抗c-Jun和GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)抗體均購(gòu)自 Cell Signaling。新生牛血清和DMEM購(gòu)自Gibco。DMSO購(gòu)自Sigma。ATP生物發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Promega。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記的細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)構(gòu)建載體來(lái)自美國(guó)紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院Huang Chuanshu實(shí)驗(yàn)室［6］。具體為:真核表達(dá)載體pEGFP-C3經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切。根據(jù)GenBank中人cyclin D1 cDNA序列設(shè)計(jì)合成以下引物:上游引物5’-GCGAATTCCCATGGAACACCAGCTCCTG-3’，下 游 引物 5’-GCGGATCCTCAGATGTCCACGTCCCGCA-3’。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性90 s，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共 35個(gè)循環(huán)。EcoR I和BamH I雙酶切后，以瓊脂糖膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。以T4連接酶連接pEGFP-C3和上述回收片段。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，隨機(jī)挑選菌落，并經(jīng)測(cè)序鑒定。

細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體來(lái)自Anil K.Rustgi博士(美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院腸胃科)［7］。人源性細(xì)胞周期蛋白D1野生型和-163位點(diǎn)突變型螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體(WT-cyclin D1-Luc和Sp1mut cyclin D1-Luc)來(lái)自Richard G.Pestell博士(美國(guó)托馬斯·杰斐遜大學(xué) Kimmel癌癥中心)［8］。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染 RT4和RT112膀胱癌細(xì)胞均購(gòu)自ATCC。UMUC3細(xì)胞來(lái)自美國(guó)紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院 Huang Chuanshu教授處。RT4、RT112和UMUC3膀胱癌細(xì)胞分別在 RPMI-1640、Eagle′s MEM和DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基中均含有100 mL/L新生牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

基因轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h于熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察GFP熒光。轉(zhuǎn)染72 h后，加入嘌呤霉素(puromycin)篩選4周，終濃度5 mg/L?？寺〖?xì)胞形成后，隨機(jī)挑選克隆，擴(kuò)增抗性細(xì)胞，熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)熒光。

2.2 膀胱癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1的蛋白水平表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞株細(xì)胞周期蛋白D1的蛋白水平表達(dá)。按照常規(guī)進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取、定量和分離［5，9］。轉(zhuǎn)膜后先后與10 g/L脫脂奶粉、鼠或兔抗人抗體(細(xì)胞周期蛋白D1、c-Jun和GADPH)I抗4℃孵育過(guò)夜，過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的II抗孵育，運(yùn)用ECL Western blotting Kit顯色并掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 UMUC3細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA水平表達(dá)的檢測(cè) 以ISO預(yù)處理膀胱癌細(xì)胞(約1×106細(xì)胞)后，收集按 TRIzolTM試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:模板RNA 2 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，RNA 酶抑制劑(RNasin)335 nKat，Oligo dT181 μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，5 ×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL，終體積為 25 μL。42 ℃水浴30 min，采用NCBI的Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)細(xì)胞周期蛋白D1基因的PCR引物(擴(kuò)增產(chǎn)物大小408 bp)，序列如下:上游引物 5’-GAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTG-3’，下游引物 5’-GAGGGCGGATTGGAAATGAACTTC-3’。同時(shí)以GADPH作為內(nèi)參照(擴(kuò)增產(chǎn)物大小258 bp)，上游引物 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下 游 引 物 5 ’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3 ’［9］。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，MGIAS-1000凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并拍照。

待到中午下班后，楊力生在室內(nèi)檢查了一下員工們的工作情況，檢查完畢，員工們?cè)缫炎弑M。他走出門(mén)外，正準(zhǔn)備開(kāi)車(chē)回家，卻見(jiàn)楊秋香獨(dú)自站在大門(mén)口的一棵銀杏樹(shù)下，她一見(jiàn)到楊力生便含羞地低下頭來(lái)。楊力生趕忙走到她近前，心情激動(dòng)地問(wèn)道：

2.4 PI染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 以ISO預(yù)處理膀胱癌細(xì)胞(約1×106細(xì)胞)后，胰酶消化并收集細(xì)胞，70%乙醇固定，4℃保存。600×g離心5 min，并用 PBS液(含有0.5%BSA和0.1%Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測(cè)細(xì)胞周期DNA含量和凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2.5 貼壁依賴(lài)性細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，制備含0.5%軟瓊脂、10%胎牛血清、不同濃度ISO底層的Basal Medium Eagle(BME)培養(yǎng)基底層。靜置4 h凝固后，1×104UMUC3細(xì)胞混懸于含10%胎牛血清、0.33%軟瓊脂培養(yǎng)基和不同濃度ISO的BME培養(yǎng)基，凝固后，6孔板被保持在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d后，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)超過(guò)32個(gè)的細(xì)胞克隆數(shù)，觀(guān)察菌落及鏡下計(jì)數(shù)。每個(gè)濃度分別進(jìn)行3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)［9］。

2.6 螢光素酶報(bào)告基因分析 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記的細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)構(gòu)建載體、Sp1mut-cyclin D1-Luc和WT-cyclin D1-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒載體至UMUC3膀胱癌細(xì)胞，經(jīng)篩選鑒定后，接種到96孔板(1×104cells/well)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%，給予ISO預(yù)處理后，在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液［25 mmol/L Tris-磷酸(pH 7.8)、2 mmol/L EDTA、1%Triton X-100和10%甘油］，使用螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)和微孔板光度計(jì)(Berthold LB 96V)檢測(cè)細(xì)胞的螢光素酶活性。每個(gè)濃度分別進(jìn)行3 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)［10］。

2.7 核蛋白提取及Western blotting法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子 UMUC3細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，ISO預(yù)處理12 h后，以核/細(xì)胞質(zhì)分離試劑盒(BioVision)所提供的試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取細(xì)胞的核蛋白和胞漿蛋白，并進(jìn)行定量，在-80℃冰箱內(nèi)保存。按照Western blotting法，每孔分別上樣40 μg胞漿蛋白和核蛋白，檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子變化情況。

2.8 染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP) 根據(jù)ChIP試劑盒(Millipore)提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。即UMUC3細(xì)胞以DMSO處理或ISO(5 μmol/L)預(yù)處理12 h后，對(duì)細(xì)胞的基因組DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。針對(duì)人源性細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子的Sp1結(jié)合區(qū)域，采用PCR擴(kuò)增引物［上游引物5’-TTCTCTGCCCGGCTTTGATCTC-3′(從 -92 到-73)，下游引物 5’-CTCTCTGCTACTGCGCCAACA-3’(從+7到+27)］進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙啶染色，并進(jìn)行紫外光掃描［9］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。對(duì)各組之間采用t檢驗(yàn)或方差分析，SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ISO可顯著抑制多種膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)

將UMUC3、RT112和RT4細(xì)胞與不同劑量(0～20 μmol/L)ISO培養(yǎng)24 h后，收集膀胱癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，經(jīng) Western blotting檢測(cè)均可見(jiàn)，5、10和 20 μmol/L ISO呈劑量依賴(lài)性地抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)(P＜0.01)，見(jiàn)圖1。由于UMUC3膀胱癌細(xì)胞株有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移傾向，并且高表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1，所以選定該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.ISO inhibited cyclin D1 protein expression in different human bladder cancer cells.Cyclin D1 protein expression was determined by Western blotting after the cells were treated with the indicated concentrations of ISO for 24 h.圖1 ISO可顯著抑制多種膀胱癌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)

2 ISO可下調(diào)膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1基因轉(zhuǎn)錄水平和Sp1核轉(zhuǎn)錄因子水平

如圖2A所示，不同劑量(0～20 μmol/L)ISO作用24 h可顯著下調(diào)UMUC3細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果表明，ISO預(yù)處理可在轉(zhuǎn)錄水平或mRNA的穩(wěn)定性水平抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。為此，將細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到UMUC3細(xì)胞，檢測(cè)ISO對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1轉(zhuǎn)錄活性的影響。如圖2B所示，ISO可呈時(shí)間依賴(lài)性地抑制UMUC3細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

接著，我們使用TRANSFAC?轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)軟件(7.0版)，對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，檢索參與調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明，人類(lèi)細(xì)胞周期蛋白D1基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)，主要包括激活蛋白1、熱休克轉(zhuǎn)錄因子 1、激活轉(zhuǎn)錄因子 2、NF-κB 和Sp1。如圖2C所示，ISO(5 μmol/L)預(yù)處理 UMUC3膀胱癌細(xì)胞后，分別收集核蛋白和胞漿蛋白，經(jīng)Western blotting檢測(cè)均可見(jiàn)分子量為106 kD的Sp1核轉(zhuǎn)錄因子受到顯著抑制，而其它核轉(zhuǎn)錄因子如c-Jun等無(wú)顯著改變。

Figure 2.ISO down-regulated cyclin D1 transcription and Sp1 protein expression.A:total RNA isolated from the UMUC3 cells treated with the indicated concentrations of ISO for 24 h was subjected to RT-PCR for determination of cyclin D1 mRNA expression level，and GAPDH was used as a loading control;B:UMUC3 stably transfected with cyclin D1 promoter-driven luciferase reporter was treated with ISO(5 μmol/L)for the indicated time to determine the inhibitory effect of ISO on cyclin D1 promoter transcriptional activity;C:cytoplasmic and nuclear extracts were isolated from the UMUC3 cells treated with either 0.1%DMSO or 5 μmol/L ISO for 12 h and were subjected to Western blotting，with the specific antibodies as indicated.GAPDH was used as protein loading control.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 h.圖2 ISO可下調(diào)UMUC3膀胱癌細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄水平和核轉(zhuǎn)錄因子Sp1水平

3 ISO不影響外源性GFP-細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)

分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP以及GFP-細(xì)胞周期蛋白D1到膀胱癌UMUC3細(xì)胞，經(jīng)篩選鑒定后，進(jìn)一步檢測(cè)ISO對(duì)內(nèi)源性和外源性細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。如圖3A所示，因GFP-細(xì)胞周期蛋白D1不含內(nèi)源性啟動(dòng)子，ISO預(yù)處理后，可顯著下調(diào)內(nèi)源性細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，而不影響外源性GFP-細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)貼壁依賴(lài)性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)(圖3B、C)，證實(shí)ISO可顯著抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的UMUC3細(xì)胞的增殖，但對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-細(xì)胞周期蛋白D1的UMUC3細(xì)胞的增殖影響較小。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，10 μmol/L ISO可誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的UMUC3細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1細(xì)胞周期阻滯(65.59%±2.52% vs 83.81% ±3.48%)，而對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-細(xì)胞周期蛋白D1的UMUC3細(xì)胞的G0/G1細(xì)胞周期影響較小(55.52% ±3.24%vs 59.49% ±3.76%)，見(jiàn)圖3D。這些結(jié)果表明，ISO可通過(guò)調(diào)控內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄水平來(lái)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞G0/G1期阻滯。

Figure 3.Exogenous expression of GFP-cyclin D1 was not inhibited by ISO and was able to reverse ISO-mediated inhibition of anchorage-independent growth of UMUC3 cells.A:UMUC3 stable transfectants，as indicated，were treated with ISO for 24 h，and the cells were extracted for detection of cyclin D1 protein expressions by Western blotting;B，C:UMUC3 stable transfectants were subjected to anchorage-independent growth assay as indicated in soft agar in the absence or presence of 10 μmol/L of ISO;D:UMUC3 stable transfectants，as indicated，were subjected to cell cycle analysis using flow cytometry after pretreatment with ISO for 48 h.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖3 外源性GFP-細(xì)胞周期蛋白D1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染UMUC3細(xì)胞后，ISO不能下調(diào)外源性細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)水平，也不能抑制ISO所介導(dǎo)的細(xì)胞增殖

4 ISO通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子Sp1與細(xì)胞周期蛋白D1的啟動(dòng)子結(jié)合，從內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄水平來(lái)抑制細(xì)胞周期D1的表達(dá)

圖4 A顯示細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)示意圖。Marampon等［8］證實(shí)，刪除了細(xì)胞周期蛋白D1的-163到-22啟動(dòng)子序列，將顯著降低細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子活性。為進(jìn)一步研究ISO所調(diào)控的細(xì)胞周期蛋白D1的啟動(dòng)子序列，我們將WT-cyclin D1-Luc和Sp1mut-cyclin D1-Luc分別與pSUPER質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染UMUC3細(xì)胞，篩選并建立UMUC3/WT-cyclin D1-Luc和UMUC3/Sp1mut-cyclin D1-Luc細(xì)胞系，以ISO(5 μmol/L)處理UMUC3膀胱癌細(xì)胞6 h、12 h和24 h后，檢測(cè)UMUC3細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白 D1啟動(dòng)子活性。如圖4B所示，UMUC3/Sp1mut-cyclin D1-Luc細(xì)胞系的細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子活性明顯低于UMUC3/WT-cyclin D1-Luc的啟動(dòng)子活性(P＜0.01)。這一結(jié)果證實(shí)ISO通過(guò)特異性抑制核轉(zhuǎn)錄因子Sp1及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄功能來(lái)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄。

Marampon等［8］亦證實(shí)，Sp1 調(diào)控人細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的作用位點(diǎn)主要位于細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子-92到+27 bp的5′-非翻譯區(qū)。為了進(jìn)一步檢測(cè)ISO對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子Sp1與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子特異性結(jié)合的影響，我們以ISO(5 mol/L)處理UMUC3細(xì)胞12 h，采用ChIP法收集DNA，使用針對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子-92到+27 bp區(qū)域的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。如圖4C所示，ISO(5 mol/L)可特異性抑制Sp1與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子-92到+27 bp區(qū)域的結(jié)合。根據(jù)上述結(jié)果，ISO的作用機(jī)制可總結(jié)如下:ISO可抑制并下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)，并通過(guò)抑制Sp1與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子-92到+27 bp的5′-非翻譯區(qū)結(jié)合，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄水平，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖4D。

Figure 4.Sp1 was a major target of ISO for its inhibitory effect on cyclin D1 transcription.A:schematic diagram of transcription factor Sp1-binding sites in human cyclin D1 promoter region;B:wild-type cyclin D1 luciferase reporter(WT-cyclin D1-Luc)or its mutant at one of the Sp1-binding sites(-163)in cyclin D1 promoter region(Sp1mut-cyclin D1-Luc)was cotransfected with pSUPER plasmid into UMUC3 cells，and the stable transfectants were exposed to ISO(5 μmol/L)for determination of cyclin D1 promoter activity;C:ChIP assay was used to analyze the effect of ISO on Sp1 binding activity to cyclin D1 promoter region;D:the proposed model of ISO regulating cyclin D1 expression in human bladder cancer cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs WT-cyclin D1-Luc.圖5 ISO通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)抑制其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄水平

討 論

泌尿系統(tǒng)來(lái)源的膀胱上皮腫瘤是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，晚期患者的治療效果仍不理想［1，11-12］。既往的一些研究表明，ISO可通過(guò)對(duì)氧化型低密度脂蛋白的抑制作用(OxLDL)來(lái)抑制牛主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的有絲分裂增殖［13］，并且具備抗氧化和抗心血管炎癥反應(yīng)［14］。但I(xiàn)SO抗腫瘤的作用機(jī)制研究接近于空白。我們新近的研究結(jié)果證實(shí)，當(dāng)ISO濃度超過(guò)20 μmol/L時(shí)可通過(guò)下調(diào)膀胱癌細(xì)胞的X染色體連鎖凋亡抑制蛋白水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞增殖［9］。ISO濃度低于20 μmol/L時(shí)，雖然沒(méi)有顯示出明顯的細(xì)胞毒作用，但卻可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［5］。其具體分子機(jī)制不明。通過(guò)開(kāi)展本研究，將進(jìn)一步深入了解中藥買(mǎi)麻藤屬及其分離出的單體ISO的抗癌活性的分子機(jī)制。

細(xì)胞周期蛋白D1為細(xì)胞內(nèi)主要的癌基因之一，又稱(chēng) PRAD1、CCND1或 BCL-1，它位于 11q13，長(zhǎng)約15 kb，含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白含295個(gè)氨基酸殘基，分子量37 kD［15］。在惡性腫瘤的形成過(guò)程中，細(xì)胞周期蛋白D1比細(xì)胞周期蛋白D2和D3更加重要［16］。多個(gè)研究證據(jù)表明，在包括致癌物質(zhì)在內(nèi)的各種促進(jìn)細(xì)胞炎癥增殖反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞突變的過(guò)程中，可首先引起細(xì)胞周期蛋白的改變。其中細(xì)胞周期蛋白D1的過(guò)度表達(dá)是惡性腫瘤過(guò)度增殖的主要原因;在包括膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和皮膚癌等多種常見(jiàn)腫瘤，均可檢測(cè)到細(xì)胞周期蛋白D1的過(guò)度表達(dá)［17］。因此，細(xì)胞周期蛋白D1是一種最常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)［18］。

本系列研究證實(shí)，ISO在濃度為5 μmol/L水平，就可在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的G0/G1期阻滯，并可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，但并不影響其細(xì)胞活力或其它細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，包括細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白B、細(xì)胞周期蛋白 E、CDK4 和 CDK6［5］。這些結(jié)果表明ISO可作為一種潛在的、以細(xì)胞周期蛋白D1為靶點(diǎn)的藥物用于預(yù)防和治療腫瘤;并對(duì)多種異常高表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的腫瘤患者，嘗試采用ISO治療具備相應(yīng)的臨床基礎(chǔ)。

研究證實(shí)，可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)水平［19］。通過(guò)本試驗(yàn)的一系列研究，證實(shí)ISO可通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1進(jìn)行調(diào)控。至目前為止，已被報(bào)道調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白 D1轉(zhuǎn)錄水平的核轉(zhuǎn)錄因子包括 NF-κB［20］、Sp1［21］、Ras/MAPK/Akt/ERK1/2［22］、PI3K/Akt［23，24］和 GSK-3β/β-catenin［25］。Sp1 是一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可直接與啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)參與包括細(xì)胞周期蛋白D1在內(nèi)的多種基因的表達(dá)和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［26］。本研究證實(shí)，ISO可抑制并下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達(dá)，并介導(dǎo)抑制Sp1與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，該結(jié)合位點(diǎn)主要位于啟動(dòng)子的-92和+27 bp的5’-非翻譯區(qū)。通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄水平，ISO可進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯并抑制其增殖。細(xì)胞周期蛋白D1是腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控及藥物治療中潛在的治療靶點(diǎn)。因此，本研究將對(duì)ISO用于預(yù)防和治療高表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的多種人類(lèi)腫瘤奠定理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究也將為治療膀胱癌和其它腫瘤提供新的思路和治療策略，為進(jìn)一步研究細(xì)胞周期蛋白D1基因在參與實(shí)體腫瘤細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞G0/G1周期調(diào)控中的作用提供了新的思路和策略。

本研究還有不足之處。如對(duì)PCR結(jié)果沒(méi)有采用real-time PCR檢測(cè);ISO可在內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，尚需進(jìn)一步地通過(guò)動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)去證實(shí);本文通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ISO可特異性抑制Sp1與細(xì)胞周期蛋白D1啟動(dòng)子區(qū)域(-92到+27 bp)的結(jié)合，還需要其它實(shí)驗(yàn)如凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)來(lái)證實(shí)。另外，ISO未對(duì)細(xì)胞內(nèi)其它細(xì)胞周期調(diào)控蛋白如CDK產(chǎn)生影響，但對(duì)其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如JNK/c-Jun、JAK/STAT等是否產(chǎn)生影響，有待下一步研究。

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