王 丹 李 超 焦雅清 汪運(yùn)舟 陶鴿如 顧小龍, 方素芳 崔 平 劉賢勇** 索 勛

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193; 2.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院， 河北張家口 075000)

兔球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)引起的、嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的寄生蟲(chóng)病(Pakandl, 2009)。兔球蟲(chóng)感染引發(fā)球蟲(chóng)病的同時(shí)還會(huì)繼發(fā)感染產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等，引起混合感染(Jingetal., 2012)。河北(崔平等，2010)、江蘇(宋鴻雁等，2012)、浙江(簡(jiǎn)永利等，2014)等地區(qū)兔球蟲(chóng)感染情況的調(diào)查結(jié)果顯示，家兔球蟲(chóng)感染率均在60%以上，甚至高達(dá)100%。其中以穿孔艾美耳球蟲(chóng)Eimeriaperforans、中型艾美耳球蟲(chóng)E.media、大型艾美耳球蟲(chóng)E.magna、無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)E.irresidua、腸艾美耳球蟲(chóng)E.intestinalis和盲腸艾美耳球蟲(chóng)E.coecicola為主要感染蟲(chóng)種(Jingetal., 2012)。

普遍認(rèn)為斷奶至3月齡仔兔感染兔球蟲(chóng)最為嚴(yán)重(Sherkovetal., 1986)，但是此日齡范圍內(nèi)的家兔對(duì)球蟲(chóng)易感性差異尚未有報(bào)道，對(duì)其進(jìn)行深入研究對(duì)于更加合理地進(jìn)行藥物防治和研究宿主抗球蟲(chóng)免疫有著十分重要的意義。

新西蘭白兔是我國(guó)常見(jiàn)的肉用商品兔，具有繁殖力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、周期短等優(yōu)勢(shì)，70日齡時(shí)即開(kāi)始出欄。因此，本研究根據(jù)新西蘭白兔生長(zhǎng)周期，選擇30、50和70日齡幼兔，研究其對(duì)中型艾美耳球蟲(chóng)和無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)的易感性，據(jù)此判斷球蟲(chóng)對(duì)不同日齡兔的危害程度，進(jìn)而為今后不同生長(zhǎng)階段的新西蘭白兔的球蟲(chóng)病防控提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與蟲(chóng)株

新西蘭白兔購(gòu)自北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠，飼養(yǎng)于無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境中，1籠2只，飼喂經(jīng)80℃烘烤2 h的飼料和飲水，糞檢無(wú)球蟲(chóng)感染者用于本次實(shí)驗(yàn)。

選擇中度致病、潛隱期較長(zhǎng)的無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)E.irresidua(Nortonetal., 1979)和潛隱期較短的中型艾美耳球蟲(chóng)E.media(Licoisetal., 1994)作為實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)種。實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)種源自2010年對(duì)河北地區(qū)兔球蟲(chóng)種類及感染率進(jìn)行調(diào)查時(shí)分離并保存的中型艾美耳球蟲(chóng)和無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)(崔平等，2010)。分別將5 000個(gè)孢子化卵囊接種于無(wú)球蟲(chóng)兔，收集顯現(xiàn)期糞便中的卵囊，經(jīng)28℃孵育至孢子化，獲得中型艾美耳球蟲(chóng)和無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)卵囊。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選取30、50和70日齡的無(wú)球蟲(chóng)新西蘭白兔各12只，共36只。用5 000個(gè)孢子化的中型艾美耳球蟲(chóng)和無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)卵囊分別接種不同日齡的兔各6只。在接種后第4～9 d(接種中型艾美耳球蟲(chóng)組)和接種后第8～14 d(接種無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)組)內(nèi)，觀察各組實(shí)驗(yàn)兔精神狀態(tài)、采食飲水、排便等情況是否正常。在顯現(xiàn)期內(nèi)每日收集每個(gè)日齡組的糞便，用于卵囊排出量統(tǒng)計(jì)。

將每份糞樣充分破碎混勻后從中抓取3份，每份2 g，置于小燒杯中，倒入60 mL飽和食鹽水，吸取充分?jǐn)嚢璧幕鞈乙撼淙敫牧见溈笋R氏計(jì)數(shù)板中，靜置3～5 min后，置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。所計(jì)卵囊數(shù)量乘以200即該樣品的每克糞便卵囊量(Oocysts per gram, OPG)。排卵囊總量=OPG ×糞重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組OPG和卵囊排出總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)組間差異性進(jìn)行單因素ANOVA分析，圖片用Graphpad Prism5.0軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

30日齡的幼兔接種后均出現(xiàn)了精神沉郁、飲食減少和腹瀉等癥狀；50日齡接種兩種球蟲(chóng)的幼兔則分別有3和2只出現(xiàn)便秘的癥狀，但并無(wú)腹瀉癥狀的出現(xiàn)；70日齡感染組則僅有1只接種中型艾美耳球蟲(chóng)的個(gè)體出現(xiàn)輕微的癥狀(表1)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔顯現(xiàn)期臨床癥狀Tab. 1 Clinical sign of rabbits during patent period

圖1 不同日齡家兔接種中型艾美耳球蟲(chóng)后顯現(xiàn)期內(nèi)OPG及排卵囊總量Fig. 1 OPG and total oocyst output of rabbits inoculated with Eimeria media during patent periodA：每克糞便卵囊量；B：排卵囊總量；*：P<0.05。圖2同。A：Oocyst per gram (OPG)；B：Total oocyst output; *: P<0.05. The same with Fig.2.

2.2 中型艾美耳球蟲(chóng)卵囊排出情況

結(jié)果顯示不同日齡的幼兔對(duì)中型艾美耳球蟲(chóng)的易感性有著較大差異。在卵囊顯現(xiàn)期，各個(gè)日齡幼兔糞便OPG檢測(cè)值差異極為顯著(圖1-A)，30日齡的幼兔卵囊排出水平遠(yuǎn)高于其他兩組(圖1-B)。從卵囊顯現(xiàn)期的第2 d開(kāi)始，每日卵囊排出量隨著日齡增加而下降。糞便OPG和每日卵囊排出量的檢測(cè)值表明新西蘭白兔對(duì)于中型艾美耳球蟲(chóng)的易感性隨著日齡的變化有著較大差異。

2.3 無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)卵囊排出情況

本次實(shí)驗(yàn)中，感染無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)的30、50、70日齡家兔的糞便總卵囊排出量分別為1.2×107、2.7×107和1.6×107(圖2-B)。從造成臨床癥狀的嚴(yán)重程度來(lái)看，雖然50日齡兔卵囊排出量最高，但30日齡兔癥狀最為嚴(yán)重(表1)。30日齡兔感染無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)球蟲(chóng)后，其顯現(xiàn)期的飲水飼料消耗均少于其他兩組，有便秘、腹瀉交替現(xiàn)象，糞便量極少。這些數(shù)據(jù)顯示30日齡斷奶前后的仔兔對(duì)無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)更易感。

圖2 不同日齡家兔接種無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)后顯現(xiàn)期OPG及排卵囊總量Fig. 2 OPG and total oocyst output of rabbits inoculated with Eimeria irresidua during patent period

3 討論

本研究對(duì)30、50、70日齡家兔分別接種相同劑量的中型艾美耳球蟲(chóng)和無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)，通過(guò)對(duì)糞便OPG和卵囊排出總量的統(tǒng)計(jì)以及臨床癥狀的觀察發(fā)現(xiàn)，30日齡的仔兔對(duì)球蟲(chóng)更易感。

研究表明未斷奶仔兔對(duì)球蟲(chóng)不易感(Coudertetal., 1991; Pakandletal., 2007)，可能原因是母乳在抵抗球蟲(chóng)感染時(shí)起到重要的作用(Rose, 1973)。當(dāng)未斷奶仔兔開(kāi)始吃料，其腸道菌群發(fā)生改變，隨日齡增加，未斷奶仔兔對(duì)球蟲(chóng)易感性增強(qiáng)，排卵囊量增加(Pakandletal., 2007)。另一方面，更大日齡家兔對(duì)球蟲(chóng)的易感性降低，可能原因是免疫系統(tǒng)的日趨完善，腸道菌群穩(wěn)定。針對(duì)家兔腸道免疫系統(tǒng)的研究顯示，家兔出生后6周隱窩生發(fā)中心出現(xiàn)B細(xì)胞，直至9周齡時(shí)，隱窩處才出現(xiàn)T細(xì)胞(Mage, 1998)。

目前，兔球蟲(chóng)病的防控仍然以藥物防治為主，但長(zhǎng)期用藥造成藥物殘留給食品安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。參考本研究結(jié)果，有針對(duì)性地對(duì)斷奶前后的仔兔進(jìn)行藥物防治，高日齡兔加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，可減輕藥物殘留的危害，避免兔球蟲(chóng)感染帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究?jī)H對(duì)新西蘭白兔的幼兔進(jìn)行了2種兔球蟲(chóng)易感性研究，并未涉及其他毛兔或者獺兔，鑒于各類商品兔在其生長(zhǎng)周期和個(gè)體發(fā)育上的差異，有必要對(duì)其他種類的兔進(jìn)行研究，比較宿主之間易感性差異，為抗球蟲(chóng)免疫的探索提供研究基礎(chǔ)。