許宇輝，梁慧春，楊 征

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認(rèn)知與心理衛(wèi)生研究中心，北京 100850)

疲勞是一種普遍的生理現(xiàn)象，主要包括精神疲勞和軀體疲勞兩種，在我國(guó)因過(guò)度疲勞致病甚至死亡的人數(shù)逐年增加，全球調(diào)查顯示，35%以上的人群處于疲勞狀態(tài)［1］。疲勞不僅伴隨著各種疾病的發(fā)生如艾滋病、肝炎及腫瘤等［2－3］，而且也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，內(nèi)分泌失調(diào)，從而引起多種疾病，如感染、糖尿病等［1，4］。自 1880 年 Mosso 開(kāi)始研究人類(lèi)疲勞至今，大量研究者對(duì)疲勞進(jìn)行了探討，并對(duì)疲勞發(fā)生的機(jī)制提出了各種假說(shuō)，如能量耗竭學(xué)說(shuō)，代謝產(chǎn)物累積學(xué)說(shuō)以及中樞遞質(zhì)失衡學(xué)說(shuō)等［5］。在疲勞的研究中，我國(guó)具有豐富的中藥資源與基礎(chǔ)，很多中藥已被廣泛用于改善疲勞，并顯示出優(yōu)越的抗疲勞作用［6］。

蟲(chóng)草是我國(guó)稀有的傳統(tǒng)藥材，目前已發(fā)現(xiàn)的蟲(chóng)草種類(lèi)至少有400多種［7］，而其中的冬蟲(chóng)夏草〔Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc〕特指產(chǎn)于青海、西藏及云南地區(qū)的蟲(chóng)草，其蟲(chóng)體為蝙蝠蛾科的蟲(chóng)草蝙蝠蛾幼蟲(chóng)。研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲(chóng)夏草具有抗腫瘤、抗衰老、耐缺氧和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種藥理學(xué)活性［8－9］。在抗疲勞領(lǐng)域的研究中，大量的研究結(jié)果也顯示了冬蟲(chóng)夏草及其提取物具有改善人體運(yùn)動(dòng)耐力，緩解機(jī)體疲勞，延長(zhǎng)嚙齒類(lèi)動(dòng)物強(qiáng)迫游泳時(shí)間等多種抗疲勞作用［10－13］。

然而，由于野生冬蟲(chóng)夏草通常只能生長(zhǎng)在3500～5000 m的青藏等地區(qū)，且必須寄生于蝙蝠蛾科的蟲(chóng)草蝙蝠蛾幼蟲(chóng)中才能生存，人們對(duì)其藥用價(jià)值的研究與運(yùn)用也受到了限制，近年來(lái)由于野生冬蟲(chóng)夏草資源的過(guò)度開(kāi)采，使其成為瀕危物種［14］。為解決這些問(wèn)題，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始致力于冬蟲(chóng)夏草及其人工替代品的研發(fā)。1982年，中國(guó)中醫(yī)研究院中藥研究所在云南迪慶藏族自治州采集到新鮮冬蟲(chóng)夏草，并從中分離出10多種真菌菌株，其蟲(chóng)體經(jīng)鑒定并確認(rèn)為蝙蝠蛾科的蟲(chóng)草蝙蝠蛾。1989年，戴如琴等［15］對(duì)其中的4個(gè)菌株進(jìn)行了培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察，并將其命名為蝙蝠蛾擬青霉［15］。隨著發(fā)酵培育技術(shù)的發(fā)展與運(yùn)用，冬蟲(chóng)夏草中提取的蝙蝠蛾擬青霉菌株可通過(guò)人工發(fā)酵培育的方式進(jìn)行大規(guī)模的無(wú)性繁殖與生產(chǎn)。由此獲得的蝙蝠蛾擬青霉菌絲體(Paecilomyces hepiali mycelium，PHM)已被成功開(kāi)發(fā)為滋補(bǔ)、保健的功能性食品或藥物，如國(guó)內(nèi)已上市的“金水寶膠囊”和國(guó)外已上市的“Cordy-MaxTM”。大量的研究表明，人工發(fā)酵培育的PHM具有與野生冬蟲(chóng)夏草相似的成分及藥理學(xué)活性［16－19］。本研究的目的是采用輪式疲勞儀建立小鼠力竭疲勞模型，并通過(guò)檢測(cè)疲勞相關(guān)的能源物質(zhì)與代謝產(chǎn)物來(lái)評(píng)價(jià)人工培育的PHM對(duì)小鼠力竭疲勞的作用，并探討其潛在的作用機(jī)制。

莫達(dá)非尼是一種中樞興奮性藥物，于1994年在法國(guó)上市，主要用于抗疲勞，調(diào)節(jié)睡眠，改善認(rèn)知以及維持高危操作人員清醒狀態(tài)［20－22］。研究發(fā)現(xiàn)，該藥能夠激動(dòng)腦內(nèi) α1腎上腺素受體［23－24］，并抑制多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加大腦皮質(zhì)和尾狀核多巴胺濃度［25－27］，其抗疲勞作用與調(diào)節(jié)中樞的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。本研究選用莫達(dá)非尼作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中所建立的力竭疲勞模型，并對(duì)比評(píng)價(jià)PHM的抗力竭疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

人工發(fā)酵培育的PHM干燥粉末(蘭州科林生物醫(yī)藥有限公司，腺苷含量為0.74 mg·g－1)溶于滅菌注射用水中，配制成濃度為14，28和56 g·L－1的混懸溶液供小鼠ig給藥。莫達(dá)非尼(山東齊魯制藥，生產(chǎn)批號(hào):110619-1，純度99.57%)溶于1%的CMC-Na 中，配制成濃度為 1.3 g·L－1的混懸溶液供小鼠 ig給藥用。給藥體積均為每 0.1 mL(10 g)。科研用試劑盒，包括糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒、乳酸試劑盒以及血清肌酸激酶試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

YLS-10B型8通道小鼠輪式疲勞儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，中國(guó))，每個(gè)輪式跑道的寬為5 cm，直徑為20 cm。UV-1200型紫外分光光度儀(上海美譜達(dá)儀器有限公司，中國(guó))。D2012小型高速離心機(jī)(Scilogex，美國(guó))。

1.2 動(dòng)物、模型制備［24］與分組

72只雄性昆明小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～22℃，濕度為50% ～60%。動(dòng)物自由攝食、飲水，并保持12 h的黑暗交替。飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為正常對(duì)照組，模型組，莫達(dá)非尼13 mg·kg－1組，PHM 140，280 和560 mg·kg－1組。除正常對(duì)照組外，其余小鼠采用輪式疲勞儀使小鼠接受每日30 min且連續(xù)18 d的強(qiáng)迫攀跑訓(xùn)練，第1 天(d 1)攀跑速度為 10.2 m·min－1，并在隨后的d 5，d 9，d 13和d 17分別將速度增加至10.8，11.4，12.0 和12.6 m·min－1;d 19 小鼠進(jìn)行速度為12.6 m·min－1，時(shí)間為60 min的力竭訓(xùn)練。除正常對(duì)照組小鼠僅給予溶媒而不參與攀跑訓(xùn)練外，其他所有小鼠均于給藥后40 min進(jìn)行強(qiáng)迫攀跑訓(xùn)練。

1.3 電擊次數(shù)及體質(zhì)量的測(cè)定

1.2項(xiàng)處理的各組小鼠，分別于d5，d9，d13，d17和d19記錄小鼠在訓(xùn)練中所受的電擊次數(shù)，并記錄小鼠每天的體質(zhì)量。

1.4 組織樣本的準(zhǔn)備與生化指標(biāo)的檢測(cè)

在d19力竭訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠置于安靜環(huán)境中休息40 min，休息過(guò)程中自由攝食、飲水。休息結(jié)束后，通過(guò)眼眶取血，并立即經(jīng)頸椎脫斷處死小鼠，在冰板上迅速取出動(dòng)物的肝和后肢肌肉組織，用冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱(chēng)重后凍存于－20℃冰箱內(nèi)。血液樣品于45°斜面靜置30 min后，以4000×g離心 15 min，取上清液，凍存于－20℃冰箱內(nèi)。按照試劑盒要求檢測(cè)以上組織樣品中肌糖原，肝糖原，血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PHM對(duì)力竭小鼠體質(zhì)量的影響

表1結(jié)果顯示，未參與攀跑訓(xùn)練的正常對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量略高于其他組動(dòng)物，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給予PHM和莫達(dá)非尼組的體質(zhì)量與模型組相比，也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明PHM和莫達(dá)非尼對(duì)小鼠的體質(zhì)量無(wú)影響。

2.2 PHM對(duì)力竭小鼠電擊次數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示，與模型組相比，莫達(dá)非尼組小鼠在首次給藥后便能明顯降低小鼠的電擊次數(shù)，且d9，d13和d17所記錄的電擊次數(shù)仍顯著低于模型組(P ＜0.01)。PHM 280和560 mg·kg－1組在連續(xù)給藥17 d后，其電擊次數(shù)才開(kāi)始顯著低于模型組(P＜0.01)。在d19的力竭訓(xùn)練中，莫達(dá)非尼組和PHM 280和560 mg·kg－1組的電擊次數(shù)顯著下降(P ＜0.01)。此外，PHM 140 mg·kg－1雖然在一定程度上減少了小鼠的電擊次數(shù)，但與模型組相比并無(wú)顯著性差異。

Tab.1 Effect of Paecilomyces hepiali mycelium(PHM)on body mass of exhausted mice

2.3 PHM對(duì)小鼠肌糖原、肝糖原、血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶水平的影響

表3結(jié)果顯示，與未參與攀跑訓(xùn)練的正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肌糖原和肝糖原水平顯著降低(P＜0.01)，而血清尿素氮和血清肌酸激酶水平則顯著升高(P＜0.05)，說(shuō)明小鼠在接受長(zhǎng)期高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，其體內(nèi)能源供給不足，代謝產(chǎn)物累積過(guò)度。然而，這種致疲勞的改變可以通過(guò)連續(xù)使用PHM而得到改善或恢復(fù)，尤其是PHM 560 mg·kg－1不僅能有效升高由高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致低水平的肌糖原和肝糖原(P＜0.01)，還能顯著降低由高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致高水平的血清尿素氮，血清乳酸和血清肌酸激酶(P＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照藥物為莫達(dá)非尼對(duì)于長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致的疲勞相關(guān)能源物質(zhì)含量的下降及代謝產(chǎn)物的累積并無(wú)明顯的改善作用。

Tab.2 Effect of PHM on number of electric shocks of exhausted mice

Tab.3 Effect of PHM on fatigue-related biochemical parameters of exhausted mice

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PHM連續(xù)給藥17 d后能夠顯著降低小鼠的電擊次數(shù)，并能顯著增加小鼠體內(nèi)肌糖原和肝糖原水平，降低致疲勞代謝產(chǎn)物血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶的水平。PHM抗疲勞機(jī)制與莫達(dá)非尼并不相同，PHM可能通過(guò)增加機(jī)體糖原的儲(chǔ)備，增強(qiáng)有氧代謝，并減少運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)致疲勞代謝產(chǎn)物的積累而起到抗疲勞的作用。

一直以來(lái)，許多研究中均采用強(qiáng)迫游泳模型來(lái)進(jìn)行力竭疲勞實(shí)驗(yàn)，但存在易致動(dòng)物嗆水，造成動(dòng)物恐懼等缺點(diǎn)。目前，一些研究也開(kāi)始關(guān)注并利用嚙齒類(lèi)動(dòng)物善于攀跑的特性，通過(guò)采用輪式疲勞儀來(lái)強(qiáng)迫動(dòng)物接受長(zhǎng)期的攀跑訓(xùn)練，以此來(lái)模擬動(dòng)物的力竭疲勞［28－29］。與強(qiáng)迫游泳模型相比，輪式疲勞儀能夠避免人為計(jì)時(shí)誤差、動(dòng)物嗆水、恐懼等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾，同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況來(lái)調(diào)整和設(shè)置動(dòng)物攀跑訓(xùn)練的各種條件和參數(shù)，如運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度以及運(yùn)動(dòng)時(shí)間等。在訓(xùn)練過(guò)程中，儀器通過(guò)電擊來(lái)強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)并自動(dòng)記錄動(dòng)物的被電擊次數(shù)，從而更客觀地反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力與疲勞的發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照藥莫達(dá)非尼在首次給藥后便能顯著減少動(dòng)物的電擊次數(shù)，增強(qiáng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)耐力，但其對(duì)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致體內(nèi)肌糖原，肝糖原，血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶改變并無(wú)影響，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似［24，30］。許多研究顯示，莫達(dá)非尼能夠激動(dòng)腦內(nèi) α1腎上腺素受體［23－24］，抑制多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體，增加大腦皮質(zhì)和尾狀核多巴胺濃度［25－27］的作用，并能增加動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)。因此，其抗疲勞作用可能與調(diào)節(jié)中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。PHM首次給藥并不能馬上起效，但其在連續(xù)給藥17 d后開(kāi)始顯示出抗疲勞作用，在顯著降低小鼠電擊次數(shù)的同時(shí)，還能顯著增加小鼠體內(nèi)肌糖原和肝糖原含量，并降低血清尿素氮、血清乳酸以及血清肌酸激酶水平。此外，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，PHM 具有鎮(zhèn)靜、催眠作用［31］，由此說(shuō)明，PHM抗力竭疲勞的機(jī)制與莫達(dá)非尼不同，與調(diào)節(jié)中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平無(wú)關(guān)。

目前對(duì)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的形成機(jī)制有多種理論學(xué)說(shuō)，如“能源耗竭理論”，“代謝產(chǎn)物累積理論”及“內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失衡理論”等［5，32］。這些理論學(xué)說(shuō)認(rèn)為，疲勞是由機(jī)體運(yùn)動(dòng)后能源物質(zhì)儲(chǔ)備下降，致疲勞的代謝產(chǎn)物累積以及由此引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡等多種因素引起［5，32－33］。研究表明，運(yùn)動(dòng)所致的體能耗竭總是與糖原的耗竭同時(shí)發(fā)生。當(dāng)機(jī)體進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌糖原可迅速被動(dòng)用，從而為肌肉的收縮提供能量，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，肌糖原逐漸耗竭。此時(shí)，為維持正常的血糖水平，機(jī)體開(kāi)始動(dòng)用肝糖原，進(jìn)而導(dǎo)致肝糖原減少［34］。糖原的耗竭將會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，尤其是運(yùn)動(dòng)耐力。因此，體內(nèi)肌糖原和肝糖原的含量是反映軀體運(yùn)動(dòng)耐力和疲勞發(fā)生快慢或程度的敏感指標(biāo)［35－37］。通常情況下，糖原等物質(zhì)的有氧代謝是機(jī)體的主要供能方式，1 mol葡萄糖可凈生成32或34 mol ATP。但是在長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)，由于有氧代謝的速度較慢，無(wú)法及時(shí)滿(mǎn)足能量需要，因此機(jī)體通過(guò)無(wú)氧糖酵解方式迅速生成ATP供能。然而，1 mol葡萄糖經(jīng)糖酵解方式只能凈生成2 mol ATP，其供能效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有氧代謝，不僅增加了糖原消耗的速度和程度，同時(shí)還導(dǎo)致機(jī)體生成大量的乳酸。研究表明，乳酸作為無(wú)氧糖酵解的產(chǎn)物會(huì)引起骨骼肌細(xì)胞內(nèi)H+和無(wú)機(jī)磷(Pi)的堆積，從而抑制橫橋活性和肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放，并降低肌纖維對(duì)Ca2+的敏感性，最終使肌細(xì)胞收縮功能下降而出現(xiàn)疲勞［38－41］。因此，乳酸水平也是反映機(jī)體有氧代謝能力和疲勞程度的重要指標(biāo)。此外當(dāng)糖原代謝所提供的能量無(wú)法滿(mǎn)足機(jī)體運(yùn)動(dòng)所需的能量時(shí)，機(jī)體會(huì)動(dòng)員脂肪的分解，甚至蛋白質(zhì)的分解來(lái)提供能量，從而使蛋白代謝產(chǎn)物血清尿素氮的含量升高，因而通過(guò)檢測(cè)機(jī)體血清尿素氮的含量也可以反映出機(jī)體的運(yùn)動(dòng)供能和代謝情況，從而間接提示機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力與疲勞程度［42］。當(dāng)機(jī)體功能不足時(shí)，體內(nèi)血清肌酸肌酶能夠代償性的增加，從而促進(jìn)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)換為肌酸，并進(jìn)一步促使肌酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰姿峒∷岱肿樱宰鳛榧?xì)胞快速獲取能量的來(lái)源。但是，血清肌酸肌酶含量的增加會(huì)對(duì)肌肉造成物理或化學(xué)形式的損傷，從而降低機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力，加重機(jī)體的疲勞狀況［43－44］。因此，體內(nèi)血清肌酸激酶含量的升高可以反映出機(jī)體供能不足和運(yùn)動(dòng)能力下降。

綜上，PHM可能通過(guò)增加能源物質(zhì)的儲(chǔ)備，增強(qiáng)機(jī)體有氧代謝能力，并減少機(jī)體致疲勞代謝產(chǎn)物的積累，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及正常代謝功能，從而起到抗力竭疲勞的作用。PHM作為冬蟲(chóng)夏草替代品用于緩解疲勞可能具有一定的潛力和良好的前景。

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