劉 洋，戴 琳，張遠(yuǎn)恒，王金麗，張存泰，薛玉梅，吳書林，胡 丹，5，喻榮輝，劉 念，白 融

(1.廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院，廣東省心血管病研究所，廣東廣州 510080;2.煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院心電圖室，山東煙臺(tái) 264001;3.武漢市第三醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢 430060;4.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，湖北武漢 430030;5.Masonic Medical Research Laboratory，Utica，NY13501，USA;6.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100029)

先天性長(zhǎng) QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是一組具有家族遺傳特性的原發(fā)性心電疾病，其臨床特征為心電圖上QT間期延長(zhǎng)、ST－T段形態(tài)異常及反復(fù)發(fā)作的尖端扭轉(zhuǎn)型室速(torsades de pointes，TdP)，部分患者可表現(xiàn)為心臟性猝死［1］。目前，基因?qū)W研究已發(fā)現(xiàn)15種 LQTS亞型［1］，其中 45% 的患者為 2 型 LQTS(LQT2)［2］。LQT2的發(fā)病機(jī)制是由于編碼Kv11.1通道α亞單位的 KCNH2 基因(也常稱為 human ether－a－go－go related gene，hERG)發(fā)生突變，引起心肌細(xì)胞的快速延遲整流鉀電流(rapidly delayed rectifier K+current，IKr)減少，從而導(dǎo)致復(fù)極過程延長(zhǎng)和相對(duì)應(yīng)的心電圖上QT間期延長(zhǎng)。

交感神經(jīng)興奮性增高及其伴隨的高兒茶酚胺水平是LQT2患者發(fā)生心律失常事件的最常見誘因，因此，β受體阻滯劑成為治療LQT2的主要藥物，可有效預(yù)防59%的LQT2患者發(fā)生心臟事件。然而，一項(xiàng)國際注冊(cè)研究表明，有23%的LQT2患者在服用足量β受體阻滯劑的情況下仍然出現(xiàn)心律失常［3］;對(duì)于這部分患者可能需要施行左心交感神經(jīng)去除術(shù)(left cardiac sympathetic denervation，LCSD)和(或)植入式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器(implantable cardioverter－defibrillator，ICD)來降低惡性心律失常和心臟性猝死的風(fēng)險(xiǎn)。值得關(guān)注的是，上述有創(chuàng)性治療措施可能對(duì)患者，尤其是年輕的LQT2患者的身心健康產(chǎn)生負(fù)面影響，而且ICD本身并不能預(yù)防心律失常復(fù)發(fā)，價(jià)格也相當(dāng)昂貴。因此，廣大心血管醫(yī)師一直致力于尋找安全有效的藥物作為β受體阻滯劑的補(bǔ)充治療。筆者在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，Ca2+通道阻滯劑維拉帕米對(duì)部分LQT2有很好的治療效果，能顯著降低患者的心律失常發(fā)生頻率。為此，通過制備兔左心室楔形心肌塊LQT2模型并灌注維拉帕米，記錄跨壁心電圖和跨膜動(dòng)作電位，以探討維拉帕米治療LQT2的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

E－4031，美國 Santa Cruz Biotechnology 公司;維拉帕米和硝苯地平，美國 Sigma－Aldrich Co公司。601超級(jí)恒溫水浴，金壇市醫(yī)療儀器廠;HL－2蠕動(dòng)泵，上海滬西分析儀器廠有限公司;壓力傳感器，北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司;SWF－1B高阻抗微電極放大器、YC－2型程控刺激器和RM6240USB2.0j多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠;玻璃微電極拉制儀，武漢市華中科技大學(xué)。

1.2 動(dòng)物及左心室楔形心肌塊制備

60只健康日本大白兔，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(鄂)2011－0011〕。參照文獻(xiàn)［4－7］經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌注制備兔左心室楔形心肌塊。兔經(jīng)耳緣靜脈給予戊巴比妥鈉麻醉(35～40 mg·kg－1)和肝素抗凝后，迅速由胸骨左緣打開胸腔取出心臟并將其置于4℃、K+濃度為8.5 mmol·L－1的Tyrode液中使之停跳。經(jīng)左回旋支冠狀動(dòng)脈插管并灌注停跳液。未灌注的心肌組織因紅細(xì)胞未被洗脫而呈紅色，用眼科剪移除。將修剪后的楔形心肌塊置于充滿Tyrode液的加熱浴槽中(35.7±0.2)℃，應(yīng)用蠕動(dòng)泵對(duì)心肌塊進(jìn)行普通Tyrode液持續(xù)灌注，利用壓力傳感器對(duì)灌注壓進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，并通過調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速將灌注壓維持在4.67～6.00 kPa。固定心肌塊后，將雙極電極置于心內(nèi)膜連續(xù)起搏心肌塊。Tyrode液成分(mmol·L－1):NaCl 129、KCl 4、NaH2PO40.9、NaHCO320、CaCl21.8、MgSO40.5 和葡萄糖 5.5，用含 95%O2和5%CO2的混合氣對(duì)其進(jìn)行緩沖。心臟停跳液的成分除 KCl濃度為 8.5 mmol·L－1外，其他配制同普通Tyrode液。

1.3 左心室楔形心肌塊分組及灌注

制備的大白兔左心室楔形心肌塊隨機(jī)分為正常對(duì)照組、E－4031 0.5 μmol·L－1組、E－4031+ 維拉帕米 0.5，1.0 及 2.5 μmol·L－1組，E－4031+ 硝苯地平1 μmol·L－1組，每組 10 只。所有實(shí)驗(yàn)藥物均溶解于Tyrode液中并經(jīng)動(dòng)脈插管灌注至心肌塊。正常對(duì)照組持續(xù)灌注普通Tyrode液;心肌塊穩(wěn)定1 h后開始灌注含E－4031 0.5 μmol·L－1的Tyrode液以制備LQT2模型。E－4031是一種IKr阻滯劑，在先前的研究中已被廣泛用作構(gòu)建LQT2模型［8－9］。維拉帕米干預(yù)組在心肌塊穩(wěn)定1 h后，開始灌注含E－4031 0.5 μmol·L－1和含維拉帕米0.5，1.0 和2.5 μmol·L－1的 Tyrode 液;硝苯地平灌注濃度為1.0 μmol·L－1。正常對(duì)照組的數(shù)據(jù)在心肌塊穩(wěn)定1 h后開始記錄;E－4031組、E－4031+維拉帕米組和 E－4031+硝苯地平組在用藥30 min后開始采集數(shù)據(jù)，采集時(shí)間持續(xù)30 min。

1.4 記錄心肌塊跨壁心電圖和跨膜動(dòng)作電位(transmembrane action potentials，TAP)

將一對(duì)Ag/AgCl電極對(duì)稱置于楔形心肌塊內(nèi)膜和外膜面兩側(cè)記錄心肌塊跨壁心電圖。用2根充灌KCl 2.7 mmol·L－1溶液的懸浮玻璃微電極(入水阻抗:10～20 MΩ)沿心電圖記錄電極縱軸方向分別刺入楔形心肌塊的內(nèi)膜下和外膜下心肌，同步記錄心內(nèi)膜和心外膜的TAP。心電記錄放大器(SWF－1B)與計(jì)算機(jī)相連，應(yīng)用YC－2型程控刺激儀控制刺激的發(fā)放，用RM6240USB2.0j對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集與分析;多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)完成。

在正式進(jìn)行電生理檢查之前，先以基礎(chǔ)步長(zhǎng)1000 ms起搏(S1S1刺激)心肌塊使其達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(通常為1 h)，之后再以2000 ms起搏(S1S1刺激)心肌塊并在此基礎(chǔ)上行程序刺激，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。各組心肌塊模型中記錄和評(píng)價(jià)的電生理指標(biāo)包括動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間(action potential duration，APD)、跨壁心電圖QT間期和跨壁復(fù)極離散度(transmural dispersion of repolarization，TDR)。觀察自發(fā)和程序刺激所誘發(fā)的早期后除極(early after depolarization，EAD)和 TdP。APD90為動(dòng)作電位復(fù)極達(dá)90%的時(shí)程;QT間期為跨壁心電圖QRS波的起點(diǎn)至T波降支與基線的交點(diǎn)處之間的時(shí)間;TDR是同步記錄的心內(nèi)膜和心外膜TAP上復(fù)極時(shí)間的差值。程序刺激方案采用連續(xù)5個(gè)S1S1刺激后發(fā)放一個(gè)額外刺激(S2)的方案(初始S1S2間期600 ms，每個(gè)循環(huán)遞減10～20 ms。刺激強(qiáng)度為輸出電壓0.5 mV，脈寬1 ms)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 維拉帕米和硝苯地平對(duì)LQT2模型QT間期、APD和TDR的影響

圖1和表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，在基礎(chǔ)步 長(zhǎng) 2000 ms起 搏 時(shí)，灌 注 含 E－4031 0.5 μmol·L－1的 Tyrode 液使楔形心肌塊的 QT 間期、內(nèi)、外膜下心肌 APD90顯著延長(zhǎng)(P ＜0.01)，且由于該藥物使內(nèi)膜下心肌APD90延長(zhǎng)更為顯著，導(dǎo)致TDR增加(P＜0.01)，說明 LQT2模型制備成功。

維拉帕米 0.5 ～2.5 μmol·L－1使 LQT2 心肌塊模型的QT間期、內(nèi)膜和外膜下心肌APD90產(chǎn)生濃度依賴性縮短(P＜0.01)。維拉帕米縮短內(nèi)膜下心肌APD90的作用更強(qiáng)，所以導(dǎo)致TDR減小(P＜0.01)。硝苯地平1 μmol·L－1縮短 LQT2 心肌塊模型內(nèi)、外膜下心肌的APD90，但對(duì)前者的作用更強(qiáng)，因此硝苯地平也導(dǎo)致QT間期縮短和TDR減小。與維拉帕米0.5和1.0 μmol·L－1的作用相比，硝苯地平1 μmol·L－1縮短模型QT間期、內(nèi)膜和外膜下心肌 APD90的作用更明顯(P＜0.05)，但三者對(duì)LQT2模型TDR的影響沒有差異。而維拉帕米2.5 μmol·L－1和硝苯地平 1 μmol·L－1對(duì) LQT2 心肌塊模型的QT間期、APD90和TDR的影響相似。

Fig.1 Effect of verapamil(Vera)on transmembrane action potentials(TAP)of endocardial(A)and epicardial(B)and transmural ECG(C).E－4031(0.5 μmol·L －1)was used to induce LQT2 model after rabbit left ventricular wedge preparations were equilibrated for 1 h.Vera(0.5，1.0 and 2.5 μmol·L－1，respectively)and nifedipine(Nife)1.0 μmol·L －1were perfused in different groups.Data were collected for a period of 30 min starting 30 min after adding the respective drug.TAP of endocardial and epicardial myocardium was recorded simultaneously at a basic pace，cycle length of 2000 ms(S1S1)together with a transmural ECG.

Tab.1 Effect of Vera on QT interval，action potential duration at 90%repolarization(APD90)and transmural dispersion of repolarization(TDR)in rabbit left ventricular myocardial wedge preparations pursued with E－4031

2.2 維拉帕米和硝苯地平對(duì)LQ T2模型EAD的影響

圖2和圖3為典型的程序刺激誘發(fā)的EAD。正常對(duì)照組，無自發(fā)和(或)程序刺激誘發(fā)的EAD。E－4031誘發(fā)的LQT2模型組，3例(3/10)出現(xiàn)自發(fā)的 EAD，6例(6/10)經(jīng)程序刺激誘發(fā)出 EAD。維拉帕米0.5 ～2.5 μmol·L－1完全抑制LQT2心肌塊模型中自發(fā)的 EAD(0/10)，但維拉帕米0.5和2.5 μmol·L－1僅部分抑制程序刺激誘發(fā)的EAD(1/10 和2/10)，而維拉帕米 1 μmol·L－1完全抑制程序刺激誘發(fā)的 EAD(0/10)。硝苯地平1 μmol·L－1完全抑制LQT2模型自發(fā)的EAD(0/10)，但部分抑制程序刺激誘發(fā)的EAD(2/10)。

Fig.2 Action potentials simultaneously recorded from endocardial(A)and epicardial(B)together with transmuralECG(C)in LQT2 modelwith Vera 2.5 μmol·L －1.Preparation was paced from endocardial surface at a basic cycle length of 2000 ms(S1).Single extrastimulus(S2)applied to endocardial surface initiated single early afterdepolarization(EAD).

Fig.3 Action potentials simultaneously recorded from endocardial(A)and epicardial(B)together with transmural ECG(C)in LQT2 model with Vera 2.5 μmol·L－1.Single S2 induced coupled EAD.See Fig.2 for the legend.

2.3 維拉帕米和硝苯地平對(duì)LQ T2模型TdP的影響

圖4為典型的程序刺激誘發(fā)的TdP。正常對(duì)照組未出現(xiàn)自發(fā)和(或)程序刺激誘發(fā)的 TdP。在E－4031誘發(fā)的LQT2模型組，3例(3/10)出現(xiàn)自發(fā)的TdP，5例(5/10)經(jīng)程序刺激誘發(fā)出TdP。維拉帕米0.5 ～2.5 μmol·L－1完全抑制 LQT2 模型中自發(fā)的 TdP(0/10)，維拉帕米 0.5 和 1.0 μmol·L－1完全抑制程序刺激誘發(fā)的TdP(0/10和0/10)，維拉帕米 2.5 μmol·L－1僅部分抑制程序刺激誘發(fā)的TdP(2/10)。硝 苯地 平1.0 μmol·L－1完全 抑 制LQT2模型自發(fā)的TdP(0/10)，但部分抑制程序刺激誘發(fā)的TdP(2/10)。

Fig.4 Action potentials simultaneously recorded from endocardial(A)and epicardial(B)together with transmural ECG(C)in LQT2 model with Vera 2.5 μmol·L－1.Single S2 induced torsades de pointes(TdP).See Fig.2 for the legend.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米可通過減小心室肌的TDR抑制LQT2模型室性心律失常的發(fā)生，這可以部分解釋臨床實(shí)踐中鈣離子拮抗劑有效治療LQT2患者的作用機(jī)制。

Shimizu等［10］曾通過記錄 LQTS患者的心肌單相動(dòng)作電位(monophasic action potential，MAP)來研究維拉帕米對(duì)腎上腺素誘導(dǎo)的心肌復(fù)極異常的影響。他們發(fā)現(xiàn)維拉帕米可改善腎上腺素在LQTS患者中誘導(dǎo)出現(xiàn)的心肌復(fù)極異常，縮短MAP時(shí)程，減少不同部位之間MAP時(shí)程離散度，消除或減少EAD的發(fā)生，抑制TdP發(fā)作，這與筆者的結(jié)果是一致的。但是，他們當(dāng)時(shí)并未按LQTS的基因亞型對(duì)維拉帕米的作用機(jī)制深入研究，無法判斷維拉帕米是對(duì)所有腎上腺素敏感性LQTS都有效還是只對(duì)某些基因亞型有效，制約了該研究結(jié)果對(duì)臨床實(shí)踐的指導(dǎo)意義。由于該研究入選的LQTS患者都發(fā)生過應(yīng)激誘發(fā)的暈厥(或TdP)，筆者推測(cè)該研究的對(duì)象很可能是 LQT1和(或)LQT2患者［11－12］;另一方面，β 受體阻滯劑只對(duì)部分 LQT2有效，因此，臨床上更需要有針對(duì)LQT2患者的、除β受體阻滯劑以外的備選藥物。最近，有研究顯示，維拉帕米亦可有效抑制LQT7和LQT8患者室性心律失常的發(fā)生［13－14］，表明維拉帕米可以作為部分LQTS患者的藥物治療策略之一。

Milberg 等［15］利用 Langendorff灌流的兔全心模型評(píng)價(jià)了維拉帕米對(duì)LQT3模型室性心律失常的影響。他們通過藜蘆定抑制鈉通道失活構(gòu)建LQT3模型，結(jié)果顯示維拉帕米能顯著縮短心內(nèi)膜MAP時(shí)程，因而減小TDR;低鉀誘發(fā)的EAD和TdP也完全被維拉帕米所抑制。在完全敲除KCNE1基因(編碼快速延遲整流鉀通道β亞單位)的LQT5模型小鼠上，Balasubramaniam等［16］觀察到硝苯地平可以完全抑制異丙腎上腺素誘發(fā)的室性心律失常。類似地，在SCN5A基因編碼的鈉通道1505～1507位氨基酸缺失(ΔKPQ)的轉(zhuǎn)基因小鼠上，Thomas等［17］觀察了硝苯地平對(duì)LQT3模型室性心律失常發(fā)生情況的影響。他們同樣利用Langendorff灌流全心模型記錄心肌內(nèi)、外膜MAP，發(fā)現(xiàn)硝苯地平呈濃度依賴性抑制自發(fā)的EAD和程序刺激誘發(fā)的室性心動(dòng)過速。但是，在Thomas等的研究中，硝苯地平對(duì)LQT3 Langendorff灌流全心模型的心肌內(nèi)、外膜APD90和ΔAPD90沒有顯著影響，這與筆者在LQT2心肌塊模型上觀察到現(xiàn)象不同;這個(gè)差別可能是由于Thomas的研究采用較短的基礎(chǔ)刺激步長(zhǎng)記錄MAP，初始APD90值較小，從而導(dǎo)致用藥前后內(nèi)外膜心肌的APD90的差異性難以表現(xiàn)出顯著性。在藥物模擬的LQT1合并LQT2模型或快速起搏制備的心力衰竭模型中，采用左心室楔形心肌塊或Langendorff灌流全心技術(shù)都已證實(shí)維拉帕米可使QT間期和APD顯著縮短、減小TDR并抑制EAD或室性心律失常的發(fā)作［18－19］。筆者的研究結(jié)果與上述報(bào)道大體相似，維拉帕米縮短LQT2模型的APD90，且對(duì)內(nèi)膜下心肌的作用更為明顯，使內(nèi)、外膜TDR減小，從而抑制TdP的發(fā)生。但難以解釋的是，本研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的維拉帕米可以完全抑制LQT2模型中室性心律失常的發(fā)生，而高濃度的維拉帕米僅起到部分抑制的作用。

LQT2是由于hERG通道功能缺失引起心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)外向電流減少所致，因此使用Ca2+通道阻滯劑減少動(dòng)作電位復(fù)極相的內(nèi)向電流可以抵消或補(bǔ)償外向電流的減少，重新建立離子流之間的平衡。但是過度抑制內(nèi)向電流，可能再次打破新建立的平衡:內(nèi)向電流的過分減少，引起APD過度縮短和不應(yīng)期相應(yīng)縮短，從而在一定程度上增加了觸發(fā)心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。

作為苯烷胺類Ca2+通道阻滯劑，維拉帕米并非單純地阻滯 L型 Ca2+電流(ICa，L)，對(duì) IKr和晚鈉電流(INa，L)等也有阻滯作用［3，20－22］。因此，本研究將單純的Ca2+通道阻滯劑硝苯地平作為研究對(duì)象，以明確維拉帕米對(duì)LQT2的治療作用是否為ICa，L電流阻滯的結(jié)果。與預(yù)期的結(jié)果一樣，維拉帕米和硝苯地平對(duì)LQT2心肌塊模型的QT間期、APD和TDR的影響趨勢(shì)是一致的，這說明維拉帕米減少TDR和抑制LQT2模型室性心律失常發(fā)生的作用是通過阻滯ICa，L電流產(chǎn)生的。但是由于兩種藥物阻滯Ca2+通道的位點(diǎn)不同［23］，硝苯地平對(duì)LQT2心肌塊模型各電生理參數(shù)的影響要比相同濃度維拉帕米的作用強(qiáng)。硝苯地平是二氫吡啶類Ca2+通道阻滯劑，結(jié)合于Ca2+通道的細(xì)胞膜外側(cè)，它的作用不依賴通道的開放、不存在頻率依賴性;而維拉帕米在Ca2+通道上的結(jié)合位點(diǎn)靠近細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在其發(fā)揮阻滯作用前需先進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此它的作用有賴于Ca2+通道本身的開放，且存在頻率依賴性。所以，在相同的刺激頻率下，同一濃度的硝苯地平阻滯ICa，L的作用要比維拉帕米強(qiáng)。

目前認(rèn)為，在LQTS患者中，TdP的起始是由EAD所觸發(fā)，而TdP的維持是因?yàn)門DR的增加形成的折返機(jī)制［24］。其中EAD的產(chǎn)生與Ca2+內(nèi)流有關(guān)，筆者認(rèn)為維拉帕米是通過阻滯ICa，L電流抑制EAD的發(fā)生同時(shí)減小TDR，從而發(fā)揮在LQT2患者的抗心律失常作用。第一次暈厥發(fā)作后未經(jīng)治療的LQTS患者15年的累積死亡率 ＞53%［25］;藥物治療盡管不能降低死亡率，但是可以減少ICD的放電，提高LQTS患者的生活質(zhì)量，所以藥物治療對(duì)于有癥狀的LQTS患者即使在植入ICD后仍然是必需的。但臨床上確有部分LQT2患者對(duì)足量的β受體阻滯劑干預(yù)反應(yīng)欠佳。本研究表明，維拉帕米可以有效抑制LQT2模型中TdP的發(fā)生。所以，對(duì)于β受體阻滯劑治療無效、不能耐受β受體阻滯劑或有β受體阻滯劑使用禁忌的LQT2患者，維拉帕米可作為藥物治療的另一種選擇。

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