暢立斌 鮑永珍 黎曉新 肖林

晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)的凋亡被認(rèn)為是多種非先天性白內(nèi)障形成的始發(fā)因素［1］，氧化損傷是誘導(dǎo) LEC凋亡的重要因素之一。目前晶狀體氧化損傷的研究集中在氧自由基方面，而分子氧如何影響LEC卻報道甚少。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)能夠顯著提升組織內(nèi)的氧含量，為人們研究氧氣與白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系提供一條有效途徑。臨床試驗［2］與動物實驗［3］結(jié)果提示，長期過量的HBO可以導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生;細(xì)胞實驗［4］表明，LEC暴露在HBO下會產(chǎn)生過多的氧自由基，使細(xì)胞停止分裂，死亡率達(dá)到50%，然而哪些細(xì)胞通路參與這一過程國內(nèi)外鮮有報道。JNK在多種細(xì)胞的HBO損傷實驗中被認(rèn)為是一個重要的作用介質(zhì)［5］。為了研究 HBO和過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)對LEC的影響及JNK細(xì)胞信號通路在這一過程中的可能作用，本實驗傳代培養(yǎng)人LEC細(xì)胞系SRA01/04，并建立HBO與H2O2細(xì)胞氧化損傷模型，應(yīng)用蛋白印跡法(Western-blot)檢測氧化損傷時SRA01/04 細(xì)胞中 JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase 3、caspase 9的表達(dá)變化，從細(xì)胞通路角度闡明HBO誘導(dǎo)人LEC凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀:美國BD公司;PTC-200基因擴增儀:美國 MZ.RESEARCH公司;CO2培養(yǎng)箱:德國 Heraeus公司;倒置顯微鏡 CK30:日本OLYMPUS公司;高速冷凍離心機:日本HITACHI公司。DNA Marker I:中國天為時代科技有限公司;JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase 3、caspase 9 抗體(美國Cell signaling公司);JNK2抑制劑SP600125(德國 Merck 公司);MTT、PI、RNase A(美國 Sigma公司);Annexin V-FITC試劑盒(武漢博士德有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、MEM(Modified Eagle’s medium)培養(yǎng)液、非必需氨基酸均為美國Hyclone公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)用耗材為美國Corning公司產(chǎn)品。

1.2 SRA01/04系細(xì)胞培養(yǎng) LEC細(xì)胞系 SRA01/04細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、0.5%非必需氨基酸的 MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d換液至細(xì)胞90%融合，進(jìn)行傳代或?qū)嶒灐?/p>

1.3 LEC氧化損傷模型的建立 設(shè)計制作不銹鋼氧艙，使用前紫外線照射3 h滅菌，利用恒溫水浴鍋使氧艙內(nèi)保持恒溫37℃，滿足細(xì)胞培養(yǎng)條件，氧壓表控制艙內(nèi)氧氣壓力，通過預(yù)試驗選定HBO為600 Pa，含體積分?jǐn)?shù)95%O2和體積分?jǐn)?shù)5%CO2;H2O2濃度為 200 μmol·L－1，SP600125 濃度為 20 μmol·L－1。分為6組，A1組為對照組;A2組為 SP600125組，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入 20 μmol·L－1SP600125;B1組為 HBO組，細(xì)胞用 600 Pa HBO處理;B2組為HBO+SP600125 組，加入 20 μmol·L－1SP600125 的細(xì)胞用 HBO處理;C1組為 H2O2組，細(xì)胞用200 μmol·L－1H2O2處理;C2 組為 H2O2+SP600125組，加入20 μmol·L－1SP600125 的細(xì)胞用200 μmol·L－1H2O2處理。按實驗設(shè)計處理細(xì)胞6 h后，收集LEC進(jìn)行MTT、凋亡檢測、Western-blot檢測。

1.4 MTT檢測 MTT法檢測細(xì)胞存活率，細(xì)胞以100×103個·mL－1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔 200 μL，待細(xì)胞生長至90%融合后用無血清的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，使細(xì)胞同步化，按實驗要求處理細(xì)胞，吸去上清;用PBS緩沖液洗1次，加入100 μL MTT(終濃度為 0.5 mg·mL－1)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下避光孵育4 h后每孔加入100 μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液，輕輕振動;在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長條件下測出各孔吸光度值(OD值)，計算各孔LEC的細(xì)胞活力。

1.5 流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞 采用流式細(xì)胞儀以Annexin V-FITC凋亡檢測法檢測凋亡。按實驗分組處理細(xì)胞，按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行處理，上機檢測。所有數(shù)據(jù)均來自10×103個細(xì)胞，各實驗均重復(fù)3次或3次以上。

1.6 細(xì)胞總蛋白提取及Western-blot檢測 將細(xì)胞以每孔2.5×106個接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)分組處理到達(dá)預(yù)定時間后，提取蛋白樣品，細(xì)胞接種處理后置于冰盒上，用刮器刮取，以冷PBS洗滌1次，加入300 μL細(xì)胞裂解液(每1 mL冷 Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制劑，1 μL蛋白酶抑制劑和10 μL PMSF)，用 150 g·L－1SDS-PAGE 膠分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g·L－1牛血清白蛋白封閉1 h，分別加入 JNK、p-JNK 抗體(1∶100)、c-Jun、p-c-Jun抗體(1∶100)、caspase 3 抗體(1∶200)、caspase 9抗體(1∶200)4℃孵育過夜，TBST沖洗后加入山羊抗兔IgG(1∶2000)室溫孵育2 h，顯影、定影處理后顯示印跡條帶，結(jié)果使用Image J凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，記錄平均灰度值。

1.7 數(shù)據(jù)分析 本實驗每一組實驗數(shù)據(jù)均取自同一代細(xì)胞，每一實驗重復(fù)3次或以上，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計學(xué)方法為單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LEC活力的變化 HBO和H2O2處理LEC 6 h后，細(xì)胞活力明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)SP600125預(yù)孵育可緩解HBO和H2O2引起的細(xì)胞活力的下降，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(One-way ANOVA:F=24.8，P ＜0.05;見表1)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 對照組和SP600125預(yù)孵育的LEC中，凋亡細(xì)胞比例小于5%。經(jīng)HBO和H2O2處理后，凋亡細(xì)胞比例明顯升高，經(jīng)SP600125預(yù)孵育可降低HBO和H2O2誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞升高的幅度，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05;見表2)。

表1 MTT法檢測各組LEC細(xì)胞活力的變化Table 1 Changes of cell viability detected by MTT in each group

表2 流式細(xì)胞儀檢測各組LEC凋亡的變化Table 2 Changes of cell apoptosis assessed by flow cytometer in each group

2.3 Western-blot檢測各蛋白的表達(dá) Westernblot檢測結(jié)果顯示:各組 LEC中，JNK、c-Jun均有表達(dá)，HBO和H2O2處理和 SP600125預(yù)孵育對 JNK、c-Jun的蛋白表達(dá)量沒有明顯影響;對照組和SP600125預(yù)孵育的 LEC 中，p-JNK、p-c-Jun、caspase 3、caspase 9有少量表達(dá)，經(jīng) HBO和 H2O2處理后，p-JNK、p-c-Jun、caspase 3、caspase 9 蛋白表達(dá)量明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，經(jīng)SP600125預(yù)孵育可減低升高的幅度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05;見表3，圖1-圖4)。

表3 Western blotting檢測各組LEC相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)Table 3 Expressions of related cytokines detected by Western blotting in each group

Figure 1 Expressions of JNK，p-JNK in each group 各組 LEC JNK、p-JNK蛋白表達(dá)

Figure 2 Expressions of c-Jun，p-c-Jun in each group 各組 LEC c-Jun、p-c-Jun蛋白表達(dá)

Figure 3 Expressions of caspase 3 in each group 各組LEC caspase 3蛋白表達(dá)

Figure 4 Expressions of caspase 9 in each group 各組LEC caspase 9蛋白表達(dá)

3 討論

目前晶狀體氧化損傷的研究集中在氧自由基方面，分子氧與白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究非常有限，部分原因是由于分子氧誘導(dǎo)活體動物白內(nèi)障過程緩慢。HBO的出現(xiàn)為人們研究氧氣與白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系提供了一條有效途徑，HBO治療是將患者置于治療艙內(nèi)，施行1 Pa以上的壓力，并給予患者吸入體積分?jǐn)?shù)100%氧氣的治療方式。HBO能夠顯著提升組織內(nèi)的氧含量，并能提高氧在組織中的擴散能力。得益于這些作用，HBO在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中得以廣泛應(yīng)用。研究表明［4］，常壓純氧時血漿與房水中的氧分壓是常壓空氣時的5倍，HBO(250 Pa)時血漿、房水、玻璃體、晶狀體皮質(zhì)與晶狀體核氧分壓是常壓空氣時的12.5倍。然而，臨床發(fā)現(xiàn)過量 HBO治療可以對全身各系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。在眼科領(lǐng)域，臨床試驗與動物實驗結(jié)果提示過量的HBO可以導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生。Palmquist等［2］發(fā)現(xiàn)25名中老年腿部潰瘍患者經(jīng)150次以上HBO(250 Pa，每次1 h)后發(fā)生白內(nèi)障(治療前5人晶狀體混濁)。Giblin等［6］發(fā)現(xiàn)18個月齡豚鼠經(jīng)20～65次HBO處理后(250 Pa，每次2.5 h)發(fā)生白內(nèi)障與近視，晶狀體變化類似老年性白內(nèi)障。由于LEC的凋亡被認(rèn)為是多種非先天性白內(nèi)障形成的始發(fā)因素，本實驗旨在研究HBO對LEC的作用及其機制。

由于國內(nèi)缺少專門用于培養(yǎng)細(xì)胞的HBO艙，使得HBO對細(xì)胞影響的研究較難開展，我們自行研制細(xì)胞培養(yǎng)用 HBO艙，艙體用不銹鋼制造，艙蓋用PVC板制造，以便于觀察艙內(nèi)細(xì)胞，艙內(nèi)可同時放入5塊細(xì)胞培養(yǎng)板，使用前紫外線照射2 h，利用恒溫水浴鍋保持氧艙內(nèi)溫度達(dá)到37℃，用硅膠管將配氣瓶與氧艙相連，調(diào)節(jié)氧壓表將氧艙內(nèi)壓力控制在600 Pa，經(jīng)實驗，可滿足細(xì)胞生長條件，并能穩(wěn)定制造HBO損傷細(xì)胞模型。

我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)分子氧對LEC有損傷［7］，由于 LEC的 H2O2損傷模型是研究氧自由基與白內(nèi)障關(guān)系的經(jīng)典模型，故本文中我們同時觀察HBO與H2O2對LEC的影響以便于對照研究。本實驗通過MTT法檢測細(xì)胞活力和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況證實，600 Pa HBO作用6 h對SRA01/04的影響類似200 μmol H2O2，兩種氧化方式均能引起SRA01/04細(xì)胞活力下降和凋亡比例上升，并且證實了在這一過程中，JNK細(xì)胞信號通路被激活。JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)［8］，是哺乳類細(xì)胞中MAPK絲裂原活化蛋白激酶的一個亞類。研究證實［9］，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于包括 LEC在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞中，能將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)。JNK/SAPK多在應(yīng)激條件下被激活，與細(xì)胞凋亡及應(yīng)激時的多種病理生理過程有關(guān)。研究表明［10］，JNK/SAPK信號通路在紫外線、DMSO等誘導(dǎo)LEC凋亡的過程中起重要作用。

另外有實驗表明［11］，過量 HBO作用能激活細(xì)胞JNK/SAPK信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HBO刺激肺上皮細(xì)胞后促使細(xì)胞凋亡比例升高，在此過程中，p-JNK蛋白表達(dá)明顯增強并持續(xù)較長時間，提示JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在高氧暴露下可被激活，并參與了HBO下肺細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡效應(yīng)。阻斷或抑制JNK信號通路，可減少HBO暴露下肺細(xì)胞的凋亡，改善肺組織病理損傷，對HBO肺損傷可能起到保護(hù)作用。這提示JNK在HBO誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用。

本實驗中HBO與H2O2作用于LEC后，p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而JNK、c-Jun沒有明顯變化，這說明氧化應(yīng)激未明確提高 JNK、c-Jun的表達(dá)，而是通過促使JNK細(xì)胞信號磷酸化發(fā)揮生物學(xué)活性作用。JNK抑制劑SP600125預(yù)孵育能抑制JNK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化，并能緩解 HBO與H2O2作用引起的 LEC凋亡，更加證實了 JNK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化參與了HBO與H2O2誘導(dǎo)的LEC細(xì)胞凋亡。另外在此過程中，caspase 9和 caspase 3核酸和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，說明 caspase 9激活在HBO與H2O2誘導(dǎo)的LEC凋亡中發(fā)揮作用。caspase 9是內(nèi)源性凋亡信號通路，即線粒體相關(guān)性凋亡信號通路的關(guān)鍵因子。研究表明［12］，細(xì)胞處于應(yīng)激環(huán)境后，JNK/SAPK磷酸化引起線粒體釋放cytochrome c進(jìn)入細(xì)胞漿，激活apaf-1，依次激活caspase 9并最終激活caspase 3，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實驗中使用JNK2特異性抑制劑 SP600125預(yù)孵育 LEC后，caspase 9、caspase 3表達(dá)下調(diào)，說明在 LEC中，JNK細(xì)胞信號通路是caspase 9、caspase 3的上游因子，在兩種氧化形式應(yīng)激刺激后，JNK細(xì)胞信號通路磷酸化激活，繼而上調(diào)了 caspase 9、caspase 3的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究從JNK細(xì)胞信號通路的角度探討了HBO和 H2O2對 LEC的影響，實驗結(jié)果顯示過量HBO和H2O2會通過JNK細(xì)胞信號通路激活LEC內(nèi)源性凋亡途徑，從而導(dǎo)致LEC凋亡，提示分子氧和氧自由基均是白內(nèi)障發(fā)生的危險因素，并為白內(nèi)障的預(yù)防和藥物干預(yù)提供了新的思路。

1 Spalton DJ，Russell SL，Evans-Gowing R，Eldred JA，Wormstone IM.Effect of total lens epithelial cell destruction on intraocular lens fixation in the human capsular bag［J］.J Cataract Refract Surg，2014，40(2):306-312.

2 Palmquist BM，Philipson B，Barr PO.Nuclear cataract and myopia during hyperbaric oxygen therapy［J］.Br J Ophthalmol，1984，68(2):113-117.

3 Simpanya MF，Ansari RR，Suh KI.Aggregation of lens crystallins in an in vivo hyperbaric oxygen guinea pig model of nuclear cataract dynamic light-scattering and HPLC analysis［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(12):4641-4651.

4 Padgaonkar VA.Thioredoxin reductase may be essential for the normal growth of hyperbaric oxygen-treated human lens epithelial cells［J］.Exp Eye Res，2004，79(6):847-857.

5 Shyu KG，Wang BW，Chang H.Hyperbaric oxygen activates discoidin domain receptor 2 via tumour necrosis factor-alpha and the p38 MAPK pathway to increase vascular smooth muscle cell migration through matrix metalloproteinase 2［J］.Clin Sci(Lond)，2009 116(7):575-583.

6 Giblin FJ，Padgaonkar VA，Leverenz VR，Lin LR，Lou MF，Unakar NJ，et al.Nuclear light scattering，disulfide formation and membrane damage in lenses of older guinea pigs treated with hyperbaric oxygen［J］.Exp Eye Res，1995，60(3):219-235.

7 暢立斌，鮑永珍，陳宜，于文貞，黎曉新.槲皮素對高壓氧誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用［J］.中華實驗眼科雜志，2012，30(6):485-489.

8 Munshi A，Ramesh R.Mitogen-activated protein kinases and their role in radiation response［J］.Genes Cancer，2013，4(9-10):401-408.

9 Lee CA，Li G，Patel MD，Petrash JM，Benetz BA，Veenstra A，et al.Diabetes-induced impairment in visual function in mice:Contributions of p38 MAPK，RAGE，Leukocytes，and Aldose Reductase［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2014，55(5):2904-2910.

10 Long AC，Colitz CM，Bomser JA.Apoptotic and necrotic mechanisms of stress-induced human lens epithelial cell death［J］.Exp Biol Med，2004，229(10):1072-1080.

11 Romashko J 3rd1，Horowitz S，F(xiàn)ranek WR，Palaia T，Miller EJ，Lin A，et al.MAPK pathways mediate hyperoxia-induced oncotic cell death in lung epithelial cells［J］.Free Radic Biol Med，2003，35(8):978-993.

12 Tournier C，Hess P，Yang DD.Requirement of JNK for stress-induced activation of the cytochrome c-mediated death pathway［J］.Science，2000，288(5467):870-874.