孫亮華　劉帥兵　趙衛(wèi)飛

摘要：細菌染色體上的毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控毒素活性，從而控制細胞的生長速度和死亡，使細菌適應(yīng)各種環(huán)境脅迫。為了證明集胞藻PCC 6803染色體上relNEs TA系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，構(gòu)建了以無啟動子的β-半乳糖苷酶（lacZ）基因為報告基因的重組質(zhì)粒，并測定含轉(zhuǎn)錄融合重組質(zhì)粒的大腸桿菌細胞的β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明，抗毒素RelN能顯著抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，而毒素RelEs能部分減弱這種抑制作用，提示relNEs系統(tǒng)的編碼產(chǎn)物對該操縱子具有反饋調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：集胞藻；染色體；毒素-抗毒素系統(tǒng)；relNEs；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；轉(zhuǎn)錄融合重組質(zhì)粒；β-半乳糖苷酶活性

中圖分類號： Q756文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0040-03

收稿日期：2013-12-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：30771176）。

作者簡介：孫亮華（1987—），男，河南信陽人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物（藍藻）方面的研究。E-mail：slhyspa@163.com。

通信作者：劉朝瑩，博士，主要從事環(huán)境微生物學(xué)的教學(xué)研究工作。E-mail：melinka@163.com。毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxin-antitoxin system，TA）由位于同一操縱子中的抗毒素基因和毒素基因構(gòu)成，二者共同表達[1]。其中抗毒素基因編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白，毒素基因編碼穩(wěn)定的毒素蛋白；抗毒素基因編碼的毒素蛋白可被依賴ATP的蛋白酶降解成不穩(wěn)定的抗毒素蛋白，與毒素蛋白相互作用形成TA復(fù)合體，可抑制毒素的細胞毒性。TA蛋白復(fù)合體可以通過抗毒素蛋白結(jié)合于TA系統(tǒng)中啟動子的調(diào)控序列上，從而反饋調(diào)控TA系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄[1]。細菌染色體上的TA系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控毒素活性，從而控制細胞的生長速度和死亡，使細菌適應(yīng)各種環(huán)境脅迫[2]。藍藻是一類古老的放氧光合細菌，具有獨特的環(huán)境適應(yīng)能力能和極強的生態(tài)競爭優(yōu)勢。集胞藻（Synechocystis） PCC6803染色體上的基因ssr1114/slr0664構(gòu)成TA系統(tǒng)，其中slr0664為毒素基因（relEs），ssr1114為抗毒素基因（relN）[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復(fù)合體，能夠抑制毒素的毒性作用[2]。目前relNEs TA系統(tǒng)編碼產(chǎn)物對其操縱子是否具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用尚不清楚。本研究以來源于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）為報告基因，構(gòu)建了relNEs操縱子與lacZ的轉(zhuǎn)錄融合質(zhì)粒，通過對含有這些質(zhì)粒的重組菌株的β-半乳糖苷酶活性的分析，確定了該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株與質(zhì)粒試驗菌株為Escherichia coli DH5α，質(zhì)粒為筆者所在實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2試劑主要試劑有：鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、溴化乙錠（EB）、各類抗生素、分子生物學(xué)試劑等，均購自寶生物（大連）有限公司。引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.1.3儀器主要儀器有：Mastertycler型PCR儀（Eppendorf），722型分光光度計，DY-6025型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，THZ-82 B型氣浴恒溫振蕩器，HSS-1數(shù)字式超級恒溫浴槽等。

1.2試驗方法

1.2.1菌株、質(zhì)粒的培養(yǎng)條件將用于質(zhì)?？寺〉乃拗骶鶨scherichia coli DH5α在37 ℃、LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在含有質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素（硫酸卡拉霉素的工作濃度為50 μg/mL，壯觀霉素的工作濃度為100 μg/mL，雙抗時則各自減半）。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒的構(gòu)建按分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法進行。以T4 DNA聚合酶獲得平末端化重組DNA。以集胞藻PCC 6803染色體為模板，用特異性引物（表1）通過PCR擴增相應(yīng)的DNA片段。PCR反應(yīng)體系按產(chǎn)品的說明設(shè)定，所用程序依反應(yīng)對象設(shè)置。

2結(jié)果與分析

2.1relNEs操縱子啟動子結(jié)構(gòu)分析

在relNEs操縱子中，抗毒素基因relN位于毒素基因relEs上游，二者有11個核苷酸序列的重疊（ATGTCGAATAA），提示二者可能構(gòu)成一個二元操縱子，在同一啟動子控制下共轉(zhuǎn)錄。對relNEs操縱子可能的啟動子區(qū)域進行分析發(fā)現(xiàn)，relN起始密碼子（ATG）上游2個核苷酸處有公認的核糖體結(jié)合位點（RBS，GAGGAA）；上游40個核苷酸處有方向重復(fù)序列（IR，5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′）；上游126個核苷酸處有啟動子公認的-10序列（TCCTAAAGT），145個核苷酸處存在公認的-35序列（TTGCCA）（圖1）。因此，relNEs啟動子區(qū)域（PrelNEs）含有啟動子的所有組分，PrelNEs可能是具有活性的啟動子。此外，PrelNEs含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的IR序列，relNEs操縱子編碼產(chǎn)物可能具有反饋調(diào)控活性。

2.2relNEs操縱子與lacZ轉(zhuǎn)錄融合質(zhì)粒的構(gòu)建

為了構(gòu)建relNEs操縱子與lacZ轉(zhuǎn)錄融合質(zhì)粒，將含relNEs啟動子和relNEs編碼序列的片段克隆于報告質(zhì)粒pJS759[2]中無啟動子的報告基因lacZ上游。分別以ssr1114-1/ssr1114-2、ssr1114-1/ssr1114-B、ssr1114-1/slr0664-X為引物，PCR擴增啟動子含PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段。將擴增產(chǎn)物分別正向克隆于pMD-18T中，將得到的重組質(zhì)粒分別命名為pJS370、pJS396、pJS963。用PvuⅡ酶切重組質(zhì)粒后，回收PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段，并將這些回收產(chǎn)物分別與BglⅡ酶切后T4 DNA聚合酶補平末端的pJS759載體連接。以ssr1114-1、lacZ-R為引物，篩選PrelNEs插入方向與lacZ相同的克隆（圖2），所得的重組質(zhì)粒命名為pJS768、pJS769、pJS978，這些重組質(zhì)粒分別含轉(zhuǎn)錄融合片段PrelNEs-lacZ、PrelNEs-relN-lacZ、PrelNEs-relN-relEs-lacZ（圖3-A）。

2.3relNEs啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控

分別用轉(zhuǎn)錄融合質(zhì)粒pJS768、pJS769和pJS978轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，重組菌株分別命名為E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空載體的重組質(zhì)粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作為對照，測定各重組菌株細胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3-B結(jié)果顯示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性顯著高于對照菌株，表明啟動子PrelNEs具有轉(zhuǎn)錄活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性顯著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN對啟動子PrelNEs具有負調(diào)控作用；但重組菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性。

3討論與結(jié)論

TA系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平通過降低抗毒素水平并釋放毒素來激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生長條件下，連續(xù)合成的抗毒素蛋白與毒素蛋白形成TA蛋白復(fù)合體，與操縱子序列結(jié)合從而抑制TA操縱子的轉(zhuǎn)錄。在脅迫條件下，依賴ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平增加[1-2]。如大腸桿菌中，氨基酸饑餓激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系統(tǒng)的抗毒素蛋白，從而激活該TA系統(tǒng)[3-7]。已證明集胞藻PCC 6803染色體上的操縱子relNEs 編碼relBE家族TA系統(tǒng)，其中relEs為毒素基因，relN為抗毒素基因，分別編碼毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復(fù)合體，抑制毒素的毒性作用[2]。但與大腸桿菌中的relBE同源系統(tǒng)不同，relNEs系統(tǒng)中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，從而激活該系統(tǒng)的細胞毒性作用。

TA系統(tǒng)抗毒素的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括4個不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN與已知抗毒素?zé)o序列同源性，但二級結(jié)構(gòu)分析顯示， 其N末端含有類似于AbrB結(jié)構(gòu)域的

β-α-β結(jié)構(gòu)域，因此屬于AbrB家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[8-10]。本研究通過轉(zhuǎn)錄融合分析了relNEs操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，結(jié)果顯示，RelN可反饋抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，但RelEs能抑制RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性；在relNEs啟動子區(qū)域存在一個回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推測抗毒素蛋白RelN可能通過其N末端的類-AbrB結(jié)構(gòu)域與該序列結(jié)合，從而反饋抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。由于在細胞內(nèi)RelN與RelEs相互作用形成復(fù)合體[2]，推測RelN-RelEs可能部分抑制RelN與啟動子中的調(diào)控序列結(jié)合的能力，從而降低RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性。但RelN與relNEs的調(diào)控序列結(jié)合活性、特異性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介導(dǎo)環(huán)境脅迫因子激活該TA系統(tǒng)的過程仍需進一步通過研究證明。

參考文獻：

[1]常家寧，寧德剛. 藍細菌PCC6803染色體上的一對毒素-抗毒素基因的鑒定[J]. 微生物學(xué)通報，2009，36（1）：31-36.

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[3]汪牧西，劉朝瑩，寧德剛. 集胞藻PCC6803染色體上抗毒素-毒素基因ssl2749-sll1411的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：18-20.

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[9]Gotfredsen M，Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a new toxin-antitoxin gene family[J]. Molecular Microbiology，1998，29（4）：1065-1076.

[10]Magnuson R，Lehnherr H，Mukhopadhyay G，et al. Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1[J]. The Journal of Biological Chemistry，1996，271（31）：18705-18710.

張璠，李德茂，周雨霞. 蝦夷馬糞海膽不同腸道中菌群組成及其PCR-DGGE圖譜分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：43-45.

2.3relNEs啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控

分別用轉(zhuǎn)錄融合質(zhì)粒pJS768、pJS769和pJS978轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，重組菌株分別命名為E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空載體的重組質(zhì)粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作為對照，測定各重組菌株細胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3-B結(jié)果顯示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性顯著高于對照菌株，表明啟動子PrelNEs具有轉(zhuǎn)錄活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性顯著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN對啟動子PrelNEs具有負調(diào)控作用；但重組菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性。

3討論與結(jié)論

TA系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平通過降低抗毒素水平并釋放毒素來激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生長條件下，連續(xù)合成的抗毒素蛋白與毒素蛋白形成TA蛋白復(fù)合體，與操縱子序列結(jié)合從而抑制TA操縱子的轉(zhuǎn)錄。在脅迫條件下，依賴ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平增加[1-2]。如大腸桿菌中，氨基酸饑餓激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系統(tǒng)的抗毒素蛋白，從而激活該TA系統(tǒng)[3-7]。已證明集胞藻PCC 6803染色體上的操縱子relNEs 編碼relBE家族TA系統(tǒng)，其中relEs為毒素基因，relN為抗毒素基因，分別編碼毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復(fù)合體，抑制毒素的毒性作用[2]。但與大腸桿菌中的relBE同源系統(tǒng)不同，relNEs系統(tǒng)中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，從而激活該系統(tǒng)的細胞毒性作用。

TA系統(tǒng)抗毒素的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括4個不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN與已知抗毒素?zé)o序列同源性，但二級結(jié)構(gòu)分析顯示， 其N末端含有類似于AbrB結(jié)構(gòu)域的

β-α-β結(jié)構(gòu)域，因此屬于AbrB家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[8-10]。本研究通過轉(zhuǎn)錄融合分析了relNEs操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，結(jié)果顯示，RelN可反饋抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，但RelEs能抑制RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性；在relNEs啟動子區(qū)域存在一個回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推測抗毒素蛋白RelN可能通過其N末端的類-AbrB結(jié)構(gòu)域與該序列結(jié)合，從而反饋抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。由于在細胞內(nèi)RelN與RelEs相互作用形成復(fù)合體[2]，推測RelN-RelEs可能部分抑制RelN與啟動子中的調(diào)控序列結(jié)合的能力，從而降低RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性。但RelN與relNEs的調(diào)控序列結(jié)合活性、特異性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介導(dǎo)環(huán)境脅迫因子激活該TA系統(tǒng)的過程仍需進一步通過研究證明。

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張璠，李德茂，周雨霞. 蝦夷馬糞海膽不同腸道中菌群組成及其PCR-DGGE圖譜分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：43-45.

2.3relNEs啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控

分別用轉(zhuǎn)錄融合質(zhì)粒pJS768、pJS769和pJS978轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，重組菌株分別命名為E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空載體的重組質(zhì)粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作為對照，測定各重組菌株細胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3-B結(jié)果顯示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性顯著高于對照菌株，表明啟動子PrelNEs具有轉(zhuǎn)錄活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性顯著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN對啟動子PrelNEs具有負調(diào)控作用；但重組菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性。

3討論與結(jié)論

TA系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平通過降低抗毒素水平并釋放毒素來激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生長條件下，連續(xù)合成的抗毒素蛋白與毒素蛋白形成TA蛋白復(fù)合體，與操縱子序列結(jié)合從而抑制TA操縱子的轉(zhuǎn)錄。在脅迫條件下，依賴ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平增加[1-2]。如大腸桿菌中，氨基酸饑餓激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系統(tǒng)的抗毒素蛋白，從而激活該TA系統(tǒng)[3-7]。已證明集胞藻PCC 6803染色體上的操縱子relNEs 編碼relBE家族TA系統(tǒng)，其中relEs為毒素基因，relN為抗毒素基因，分別編碼毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復(fù)合體，抑制毒素的毒性作用[2]。但與大腸桿菌中的relBE同源系統(tǒng)不同，relNEs系統(tǒng)中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，從而激活該系統(tǒng)的細胞毒性作用。

TA系統(tǒng)抗毒素的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括4個不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN與已知抗毒素?zé)o序列同源性，但二級結(jié)構(gòu)分析顯示， 其N末端含有類似于AbrB結(jié)構(gòu)域的

β-α-β結(jié)構(gòu)域，因此屬于AbrB家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[8-10]。本研究通過轉(zhuǎn)錄融合分析了relNEs操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，結(jié)果顯示，RelN可反饋抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，但RelEs能抑制RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性；在relNEs啟動子區(qū)域存在一個回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推測抗毒素蛋白RelN可能通過其N末端的類-AbrB結(jié)構(gòu)域與該序列結(jié)合，從而反饋抑制relNEs啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。由于在細胞內(nèi)RelN與RelEs相互作用形成復(fù)合體[2]，推測RelN-RelEs可能部分抑制RelN與啟動子中的調(diào)控序列結(jié)合的能力，從而降低RelN的轉(zhuǎn)錄抑制活性。但RelN與relNEs的調(diào)控序列結(jié)合活性、特異性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介導(dǎo)環(huán)境脅迫因子激活該TA系統(tǒng)的過程仍需進一步通過研究證明。

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