王 璐，徐 剛，吳堅平，楊立榮

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系 浙江 杭州 310027）

轉(zhuǎn)氨酶（EC 2.6.1.X）廣泛存在于自然界中，是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶[1]，在細(xì)胞的氮代謝過程中發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)氨酶作為生物催化劑可用于催化制備手性胺類化合物，作為合成治療糖尿病藥物、心血管藥物、神經(jīng)類藥物、抗高血壓藥物和抗感染藥物的重要中間體[2]，具有重大的工業(yè)應(yīng)用價值[3]。通過基因工程等手段改造后的轉(zhuǎn)氨酶應(yīng)用于手性胺類醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)也成為當(dāng)前研究的熱點之一[4,5]。

西他列?。▓D1）是一種重要的糖尿病治療用藥物，是一種二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑[6]。傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)西他列汀反應(yīng)步驟復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻，且產(chǎn)率及產(chǎn)物的光學(xué)純度不高。Merck 集團(tuán)采用轉(zhuǎn)氨酶直接催化西他列汀前體酮的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)制備西他列汀取得了很好的效果，相比原本采用的化學(xué)合成方法產(chǎn)量提高了53%，轉(zhuǎn)化率提高了10%～13%，同時減少了19%的廢物排放[4,7]。轉(zhuǎn)氨酶ATA117 基因（Genbank：JA717225）源自于節(jié)桿菌屬（Arthrobactersp）KNK168 的野生型（R）-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，最初由Iwasaki 等[8-10]分離獲得。Codexis 公司發(fā)現(xiàn)這種R選擇性轉(zhuǎn)氨酶對小分子甲基酮（西他列汀前體酮的結(jié)構(gòu)類似物）具有催化轉(zhuǎn)氨的活性，進(jìn)而與Merck 集團(tuán)合作對其進(jìn)一步改良，使得轉(zhuǎn)氨酶的性能得到很大提高，用于催化制備西他列汀，產(chǎn)物光學(xué)純度（eep）大于99.95%[4]。本工作通過全基因合成的方法獲得轉(zhuǎn)氨酶ATA117 基因，并將其構(gòu)建在pETDuet-1 質(zhì)粒上，獲得基因工程菌，將其命名為Eco(pETDuet-ATA117)。為了提高轉(zhuǎn)氨酶的搖瓶發(fā)酵活力，采用響應(yīng)面法對影響轉(zhuǎn)氨酶液體發(fā)酵的培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察和評價，并對重要因素進(jìn)行優(yōu)化，以確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成，后又對誘導(dǎo)條件進(jìn)一步優(yōu)化以提高產(chǎn)酶能力。

圖1 西他列汀結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of Sitagliptin

1 材料及方法

1.1 菌種的構(gòu)建

合成轉(zhuǎn)氨酶ATA117 基因并將其構(gòu)建到質(zhì)粒pETDuet-1 上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得重組菌Eco(pETDuet-ATA117)。具體過程如下：根據(jù)基因序列，選取限制性內(nèi)切酶BamHI 和XholI，設(shè)計正向引物（5’→3’ CGGGATCCGATGGCGTTCTCAGCGGACACCC）和反向引物（5’→3’TTCCGCTCGAGGTACTGTACCGGGGTCAGCC），以合成基因為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增得到目的基因產(chǎn)物。使用BamHI 和XholI 對目的基因PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒pETDuet-1 進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后酶連過夜，構(gòu)建含有ATA117 基因的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)篩選陽性克隆子獲得重組菌Eco(pETDuet-ATA117)，-80 ℃保存于體積分?jǐn)?shù)為50%的甘油中。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基，采用LB 固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基，采用LB 液體培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油 10，酵母粉 5，胰蛋白胨 5，NaCl 10，K2HPO44。培養(yǎng)基的組成根據(jù)實驗設(shè)計進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

1.2.2 培養(yǎng)條件

菌種經(jīng)活化，接入液體種子培養(yǎng)基，在37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)8 h 后，將種子液按3%（體積比）比例接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)至光密度值(OD)為0.8，加入終濃度1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），于18 ℃，200 r/min 下誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h 后測定酶活。誘導(dǎo)條件根據(jù)實驗設(shè)計進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

1.3 轉(zhuǎn)氨酶的酶活測定

以轉(zhuǎn)氨酶催化西他列汀前體酮的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備西他列汀為模型反應(yīng)，反應(yīng)式如下：

在2 mL 反應(yīng)體系中加入50 g/L 西他列汀前體酮，1 mol/L 異丙銨鹽酸鹽（pH 值9.0），1 mmol/L磷酸吡哆醛，1 mL 發(fā)酵液離心獲得的重組E coli細(xì)胞，在45 ℃反應(yīng)30 min 后加入乙腈終止反應(yīng)。反應(yīng)液離心過濾后使用高效液相色譜法（HPLC）測定反應(yīng)液中的西他列汀生成量，確定酶活（1 個酶活力單位定義為45 ℃條件下，在1 min 內(nèi)催化生成1 μmol 西他列汀所需的酶量）。高效液相色譜系統(tǒng)為Agilent 1100；色譜條件為Agilent C18 分析柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；乙腈（流動相）與1.0 g/L乙酸銨水溶液之比為45∶55（體積比）；流速0.5 mL/min；檢測波長268 nm。

1.5 實驗設(shè)計

1.5.1 二水平因子設(shè)計法篩選影響所產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶活的因素

部分因子設(shè)計法是一種二水平的實驗優(yōu)化方法，能夠用較少的實驗次數(shù)，快速有效地從大量影響因子中篩選出重要的因子[11,12]，因此，采用二水平部分因子（two-level fractional factors，F(xiàn)F）設(shè)計法，篩選培養(yǎng)基中對產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶活力有顯著作用的組分。培養(yǎng)基中共有甘油、酵母粉、胰蛋白胨、NaCl 和K2HPO45 種組分，分別用X1，X2，X3，X4和X5表示。選用FF0508 矩陣（表1）進(jìn)行篩選，其中，5 表示待篩選的組分?jǐn)?shù)目，8 表示實施的實驗數(shù)量。每種組分設(shè)定為高水平（+1）和低水平（-1）。

表1 二水平部分因子實驗設(shè)計Table 1 Design of two-level fractional factors

1.5.2 最陡爬坡實驗（Steepest ascent design）

根據(jù)二水平部分因子設(shè)計實驗分析的結(jié)果篩選出對轉(zhuǎn)氨酶活力有顯著影響的因素，并以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定下一步試驗的最陡爬坡路徑（包括變化方向和變化步長），快速地逼近優(yōu)化區(qū)域[13]。

1.5.3 中心組合設(shè)計和用響應(yīng)面法確定培養(yǎng)基組分的濃度

通過FF0508 矩陣，可以確定培養(yǎng)基5 種組分對轉(zhuǎn)氨酶活力的影響并篩選出了起顯著作用的組分，但卻無法確定起顯著作用組分的具體濃度。采用最陡爬坡實驗確定最大產(chǎn)酶區(qū)域后，按參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行中心組合實驗，由擬合數(shù)據(jù)得到1 個描述單位發(fā)酵液酶活力與培養(yǎng)基組分條件關(guān)系的二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ?

式中：Y為預(yù)測轉(zhuǎn)氨酶活力，U/L；b為回歸系數(shù)；xi為培養(yǎng)基各組分的編碼水平，它與培養(yǎng)基組分真實值Xi的關(guān)系為：

式中：Xi0為實驗中心點處培養(yǎng)基組分的真實值；ΔXi為培養(yǎng)基組分變化步長。

用Statistical Product and Service Solutions v16.0(SPSS v16.0)對實驗數(shù)據(jù)作回歸擬合，得到擬合方程，并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析。

1.5.4 最優(yōu)培養(yǎng)基組成下轉(zhuǎn)氨酶最佳誘導(dǎo)條件的確定

采用響應(yīng)面法得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方后，在此組分配方下分別依次考察誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時機、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間對轉(zhuǎn)氨酶活力的影響，通過HPLC 酶活測定法，最終得到轉(zhuǎn)氨酶的最佳誘導(dǎo)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌Eco(pETDuet-ATA117)的構(gòu)建

采用以轉(zhuǎn)氨酶ATA117 基因為模板，設(shè)計引物對目的基因進(jìn)行PCR 擴增，經(jīng)10.0 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，各擴增產(chǎn)物的條帶與該轉(zhuǎn)氨酶基因的理論大小990 bp 完全一致（圖2）。

圖2 目的基因PCR 產(chǎn)物Fig.2 PCR products of target gene

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切驗證Fig.3 Double digestion of recombinant pETDuet-1

將目的基因與質(zhì)粒pETDuet-1 雙酶切后酶連得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E coliDH5α中并提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)10.0 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)質(zhì)粒片段和目的基因兩個條帶（圖3），大小正確，證明目的基因成功構(gòu)建到質(zhì)粒pETDuet-1 中。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主E coliBL21(DE3)中，經(jīng)氨芐霉素抗性篩選得到成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的重組菌。活化后收集誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，對其進(jìn)行超聲破碎，然后離心收集上清液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），結(jié)果如圖4所示。目標(biāo)蛋白的理論大小約為37 kD，從圖中可看出工程菌Eco(pETDuet-ATA117)的可溶性表達(dá)情況較好，幾乎無包涵體出現(xiàn)。

圖4 目標(biāo)蛋白SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of the target protein

2.2 影響轉(zhuǎn)氨酶活力的重要因素

已采用單因素優(yōu)化法篩選出對轉(zhuǎn)氨酶活力有影響的因素，分別是甘油，酵母粉，胰蛋白胨，NaCl 和為K2HPO4，采用此液體發(fā)酵培養(yǎng)基可使酶活力達(dá)到320.7 U/L，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力（125.4 U/L）有顯著增強。在此基礎(chǔ)上接著對培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化以更好地提高發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活力。培養(yǎng)基中共有5 種組分，采用 FF0508 設(shè)計進(jìn)行篩選，組分設(shè)計水平及實驗矩陣如表1和表2所示。實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理如表2和表3所示。從表3可看出：甘油、酵母粉和胰蛋白胨對轉(zhuǎn)氨酶的活力有顯著性作用；NaCl 和 K2HPO4對轉(zhuǎn)氨酶的活力沒有顯著性作用。通過對上述試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析（表3），得到了轉(zhuǎn)氨酶活力（Y1）與甘油，酵母粉，胰蛋白胨，NaCl 和K2HPO4濃度的一階回歸方程：

由回歸方程可得出：甘油，酵母粉和胰蛋白胨的回歸系數(shù)均為正值，故欲提高產(chǎn)酶量，應(yīng)增大碳源甘油、氮源酵母粉和胰蛋白胨的濃度。

表2 FF0508 實驗矩陣及結(jié)果Table 2 FF0508 experimental design and results

表3 回歸方程方法分析表Table 3 Data processing and analysis of FF0508 experiment

2.3 最陡爬坡實驗

在前面實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，圍繞甘油，酵母粉和胰蛋白胨進(jìn)行最陡爬坡實驗。實驗設(shè)計及結(jié)果見表4，甘油的步長為0.25%，酵母粉和胰蛋白胨的步長為0.15%，隨著3 個因素濃度的增大，轉(zhuǎn)氨酶活力先增加后降低，第2 組活力達(dá)到最大值，最接近最大響應(yīng)區(qū)域，故以第2 組條件為中心點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表4 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and the results of steepest ascent

2.4 響應(yīng)面實驗優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)最陡爬坡實驗，響應(yīng)變量Y值逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域，以處理2 條件為中心點進(jìn)行中心組合實驗，確定它們的最佳濃度，各自變量水平見表5，實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 中心組合設(shè)計中變量及其水平Table 5 Coding of factors and levels

表6 中心組合設(shè)計實驗矩陣及實驗結(jié)果Table 6 Experimental Design and the results of center combination

采用SPSS 軟件回歸擬合實驗數(shù)據(jù)，利用origin 軟件繪制相應(yīng)3D 響應(yīng)面圖。甘油和酵母粉之間的交互作用如圖5（a），甘油和胰蛋白胨之間的交互作用如圖5（b），酵母粉和胰蛋白胨之間的交互作用如圖5（c）。由圖可以得出甘油、酵母粉和胰蛋白胨3 個變量對產(chǎn)酶量的影響及響應(yīng)優(yōu)化區(qū)域。

圖5 甘油，酵母粉和胰蛋白胨對產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶活力的影響Fig.5 Effects of glycerol(X1), yeast extract(X2) and tryptone(X3) on transaminase activity

結(jié)合中心組合實驗結(jié)果，分析處理所得的二次經(jīng)驗?zāi)Ｐ蜑椋?/p>

式中，Y2代表轉(zhuǎn)氨酶活力。對回歸方程（4）作方差分析得表7。

從表7可看出，相關(guān)系數(shù)R為0.984，顯示實驗觀測值和預(yù)測值有很好的一致性。絕對相關(guān)系數(shù)R2為0.968，顯示回歸模型可以解釋總體變化的 96.8%，因此，從相關(guān)系數(shù)看回歸模型是顯著的。結(jié)合方差分析，F(xiàn)0.01（9,10）為4.94，F(xiàn)為34.855，F(xiàn)大于F0.01（9,10），回歸方程顯著，故可用方程（4）代替真實實驗點對轉(zhuǎn)氨酶液體發(fā)酵進(jìn)行分析和預(yù)測。

表7 中心組和設(shè)計二次回歸模型的方差分析及模型分析Table 7 Variance analysis for the regression equation

對回歸方程（4）作規(guī)劃求解可得模型極值點坐標(biāo)X1為0.76，X2為 0.51，X3為 -0.52，對應(yīng)甘油14.45 g/L，酵母粉7.27g/L，胰蛋白胨5.72 g/L，此時模型預(yù)測的最大酶活為391.7 U/L。

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最優(yōu)培養(yǎng)基配方（甘油14.45 g/L，酵母粉7.27 g/L，胰蛋白胨5.72 g/L，NaCl 10g/L，K2HPO44g/L）下進(jìn)行發(fā)酵實驗，平均所得實際發(fā)酵液活力為393.3 U/L，與模型預(yù)測值的相對偏差為0.41%，可見該模型能較好地預(yù)測實際搖瓶發(fā)酵產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶情況。

2.5 最適誘導(dǎo)條件的確定

使用響應(yīng)面法確定培養(yǎng)基最佳配方后，為進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)酶量，還需針對此配方改善轉(zhuǎn)氨酶液體發(fā)酵的誘導(dǎo)條件。分別測定不同誘導(dǎo)溫度（18，21，24 和27 ℃）條件下單位體積發(fā)酵液的轉(zhuǎn)氨酶活力，結(jié)果如圖6（a）所示。由圖可知，一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，蛋白表達(dá)量越高，活力也越高。在24 ℃時，目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況最好，無包涵體出現(xiàn)，酶的活力達(dá)到575.2 U/L，27 ℃時，蛋白表達(dá)出現(xiàn)包涵體，酶活力隨之降低。分別測定不同OD值（0.6，0.7，0.8 和0.9）條件下，單位體積發(fā)酵液的轉(zhuǎn)氨酶活力，結(jié)果如圖6（b）所示，由圖可知，在OD為0.8 時，目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況最好，酶的活力為578.2 U/L。分別測定不同IPTG 濃度（0.5，0.75，1.0 和1.25 mmol/L）條件下單位體積發(fā)酵液的轉(zhuǎn)氨酶活力，結(jié)果如如圖6（c）所示。由圖可知，一定濃度范圍內(nèi)，隨IPTG 濃度增大，蛋白表達(dá)量增大，活力提高。在1.0 mmol/L 時，目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況最好，酶的活力為579.1 U/L，超過1.0 mmol/L 時，有包涵體出現(xiàn)，酶活力降低。分別測定不同誘導(dǎo)時間（9，12，15，18）條件下，單位體積發(fā)酵液的轉(zhuǎn)氨酶活力，結(jié)果如如圖6（d）所示。由圖可知，一定誘導(dǎo)時間內(nèi)，蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間增長而增大，在誘導(dǎo)15 h 時，目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況最好，酶活力最高。超過15 h 時，酶活力降低，這與細(xì)胞破碎后釋放的蛋白酶將目標(biāo)蛋白降解有關(guān)。最優(yōu)誘導(dǎo)條件下，酶的最終活力為713.7 U/L，搖瓶發(fā)酵OD為11.8±0.7，細(xì)胞干重達(dá)到（4.82±0.17） g/L。

圖6 誘導(dǎo)條件對產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶活力的影響Fig.6 Effects of induction conditions on transaminase activity

3 結(jié) 論

轉(zhuǎn)氨酶可用于有效地制備手性胺類藥物西他列汀，通過單因素結(jié)合響應(yīng)面法快速有效地從眾多影響轉(zhuǎn)氨酶活力的培養(yǎng)基組分中篩選出更重要的組分并實現(xiàn)組分濃度的優(yōu)化，預(yù)測結(jié)果與實際發(fā)酵效果吻合較好。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基配方為甘油14.45 g/L，酵母粉7.27 g/L，胰蛋白胨5.72 g/L，NaCl 10 g/L，K2HPO44 g/L。在此響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，轉(zhuǎn)氨酶活力（391.7 U/L）分別是發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（125.4 U/L）和單因素優(yōu)化培養(yǎng)基（320.7 U/L）酶活的3.13 倍和1.22 倍。后又通過誘導(dǎo)條件，尤其是誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間的優(yōu)化，進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)酶的活力至713.7 U/L，為發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶奠定了基礎(chǔ)。

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