費(fèi)希同　唐軍榮　周軍　林源　巨苗苗　辛培堯

摘要：楊樹(shù)具有分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，是造林綠化的重要樹(shù)種。楊樹(shù)多倍體誘導(dǎo)已成為近年來(lái)?xiàng)顦?shù)育種的熱點(diǎn)，培育出的良種具有生長(zhǎng)快、抗性強(qiáng)和品質(zhì)優(yōu)的特點(diǎn)。該育種方法為林木育種提供了更為廣闊的發(fā)展空間。對(duì)近年來(lái)?xiàng)顦?shù)多倍體的誘導(dǎo)、鑒定等方面進(jìn)行了概述，并對(duì)存在的問(wèn)題提出了解決的建議，以期為楊樹(shù)多倍體育種提供理論參考。

關(guān)鍵詞：楊樹(shù)；多倍體；誘導(dǎo)；研究現(xiàn)狀

中圖分類號(hào)：S792.11；S722.3+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）18-4252-05

多倍體是指生物體細(xì)胞中含有兩套以上的基因組，是生物進(jìn)化的重要形式。在被子植物中，多倍體出現(xiàn)的頻率在30%～35%，而目前認(rèn)為在進(jìn)化過(guò)程中70%以上的種類均經(jīng)歷過(guò)多倍化，這一過(guò)程為自然界提供了豐富的基因資源[1]。自然界中尤其是在植物界，存在著大量的多倍體，其中許多都表現(xiàn)出優(yōu)良的性狀。楊樹(shù)是世界上最普遍的樹(shù)種之一，具有分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，將多倍體誘導(dǎo)技術(shù)與楊樹(shù)育種相結(jié)合，有望培育出優(yōu)良的楊樹(shù)品種。

楊樹(shù)多倍體植株在生長(zhǎng)速度、品質(zhì)以及代謝物方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[2]。其表型通常在一些性狀上優(yōu)于二倍體[3]。具體表現(xiàn)在巨大性、抗性和一些生理結(jié)構(gòu)的變化，例如生長(zhǎng)量增加、抗寒、抗旱、抗病蟲(chóng)害、器官大小、成分含量等[4]。培育出的三倍體歐洲山楊抗干旱和瘠薄性能較其親本二倍體有明顯的優(yōu)勢(shì)，并且還有較強(qiáng)的抗病蟲(chóng)害的能力[5]。楊樹(shù)的多倍體具有較高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)價(jià)值，并具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力[6-8]。例如歐洲山楊（Populus tremula）×美洲山楊（Populus tremuloides）雜交培育的三倍體植株的材積是山楊的100%～200%，纖維長(zhǎng)度增加近20%[9]。毛白楊（Populus tomentosa）在自然條件下發(fā)現(xiàn)其三倍體植株，倍性優(yōu)勢(shì)顯著，遺傳改良效果明顯高于二倍體，與毛白楊的二倍體相比木材產(chǎn)量可增加100%以上，纖維長(zhǎng)度提高近30%，出漿率是同種二倍體的200%，并且是高檔新聞紙和膠印紙的上等材料，是目前解決造紙?jiān)系淖罴哑贩N[7，9-11]。實(shí)踐證明，楊樹(shù)的三倍體植株不僅在材積上優(yōu)于二倍體，而且在木材理學(xué)方面也有良好的表現(xiàn)，并且遺傳性狀較好，具有重要的研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)價(jià)值[7，12]。

楊樹(shù)多倍體育種研究主要集中在兩方面，一方面是選育速生、高產(chǎn)、抗性強(qiáng)等優(yōu)良品種；另一方面是提高多倍體誘導(dǎo)的效率。木本植物物種的豐富性以及無(wú)性繁殖等特點(diǎn)，極大地發(fā)揮了多倍體育種的優(yōu)勢(shì)[13]。對(duì)楊樹(shù)多倍體育種過(guò)程中誘導(dǎo)途徑、鑒定方法以及育種現(xiàn)狀進(jìn)行概述，并就目前存在的問(wèn)題提出建議，以期對(duì)楊樹(shù)多倍體育種研究提供一定的理論參考。

1 楊樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法

1.1 化學(xué)誘導(dǎo)法

化學(xué)誘導(dǎo)法是利用化學(xué)誘變劑對(duì)植物染色體進(jìn)行加倍的一類手段。此類方法的原理為，施加化學(xué)物質(zhì)作用于植物微管蛋白上，致使細(xì)胞分裂形成紡錘絲的過(guò)程受到抑制，導(dǎo)致染色體不能移向兩級(jí)，使細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂中期，從而形成染色體加倍[12]?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法對(duì)分裂活躍的器官、組織或細(xì)胞的誘導(dǎo)效果明顯，所以在選擇該方法的同時(shí)，應(yīng)注意試驗(yàn)材料的選取，原則上應(yīng)選取莖尖、根尖、萌動(dòng)的種子、愈傷組織等分裂細(xì)胞較多的材料。目前使用的化學(xué)誘導(dǎo)劑有戊炔草胺、氟樂(lè)靈、安磺靈、秋水仙素等[14]，而秋水仙素被認(rèn)為是最為有效的誘導(dǎo)劑[15-20]。

1.1.1 注射法 使用注射器直接將秋水仙素等藥劑注射到待處理部位，此方法適用于楊樹(shù)2n花粉和2n大孢子的誘導(dǎo)[13]。有學(xué)者利用注射法探索四種抗微管物質(zhì)對(duì)白楊的誘導(dǎo)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用200μmol/L戊炔草胺注射花芽效果最好，2n花粉誘導(dǎo)率為84.4%，且最為經(jīng)濟(jì)。該方法快速高效，藥劑投放準(zhǔn)確，但在實(shí)施過(guò)程中，由于注射藥劑量有限，有時(shí)不能達(dá)到所需劑量，而且在注射過(guò)程中會(huì)造成組織的損傷，往往會(huì)影響誘導(dǎo)效果。

1.1.2 浸泡法 即用一定濃度的秋水仙素或其他誘導(dǎo)劑，將待誘導(dǎo)材料直接浸泡在藥液中。此方法適用于楊樹(shù)合子和胚囊體的染色體加倍[13]。具有操作簡(jiǎn)便，推廣性強(qiáng)，適用材料廣的優(yōu)點(diǎn)。研究表明，以哲引3號(hào)楊為母本，以小青楊和北京楊為父本，授粉后用秋水仙素浸泡雌花序，得到青楊雜種三倍體[20]。Einspahr[21]將美洲山楊受精后的花序浸泡在0.3%的秋水仙素溶液中6 h，成功獲得四倍體植株，并創(chuàng)造性地解決了誘導(dǎo)楊樹(shù)多倍體中產(chǎn)生嵌合體的問(wèn)題。這些研究均證明了授粉后采用秋水仙素處理是一種高效可行的三倍體誘導(dǎo)方案。

1.1.3 涂抹法 將配制好的誘導(dǎo)藥劑涂抹于材料表面。適用于楊樹(shù)幼苗莖尖染色體加倍[12]。國(guó)內(nèi)研究者采用秋水仙素處理美洲黑楊（P. deltoides）與小葉楊（P. simonii）雜交產(chǎn)生子一代并作為多倍體誘導(dǎo)的材料，先用鑷子將苗木頂端的小葉去掉，再用脫脂棉將生長(zhǎng)點(diǎn)包裹住，最后將秋水仙素滴加在脫脂棉上。結(jié)果證明，誘導(dǎo)產(chǎn)生的四倍體植株在葉綠素含量和株高等方面均優(yōu)于父母本[22]。該方法操作簡(jiǎn)便，藥劑用量少，不需損傷植物體且可以對(duì)生長(zhǎng)中的楊樹(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)，便于恢復(fù)，試驗(yàn)周期短。

1.1.4 混培法[16] 該法是將待處理材料接種在附加有誘導(dǎo)劑的組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)。利用這種方法較適用于楊樹(shù)的幼葉、愈傷組織、嫩莖以及葉柄等材料[12，20，23-25]。西南林業(yè)大學(xué)以滇楊葉柄為外植體，先在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)5 d，繼而在附加有40 mg/L秋水仙素的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)處理2 d，其誘導(dǎo)變異率可達(dá)51%[24]。此外，劉巖[23]將滇楊葉柄在附加有80～90 mg/L秋水仙素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d時(shí)，多倍化性狀明顯，誘導(dǎo)率可達(dá)16.18%。此方法誘導(dǎo)效果較好，可有效地減少嵌合體，試驗(yàn)條件易于控制且重復(fù)性強(qiáng)，在多倍體育種中有廣泛的應(yīng)用。

1.2 物理誘導(dǎo)

物理誘導(dǎo)一般采用溫度、機(jī)械損傷、γ射線等物理因素來(lái)誘使染色體加倍。石樂(lè)等[26]以毛新楊（Populus tomentosa × P. bolleana）×新疆楊（Populus alba var. pyramidalis Bunge）雜交，同時(shí)進(jìn)行39℃高溫處理，四倍體誘導(dǎo)率最高可達(dá)7.4%，并獲得一定數(shù)量的三倍體。北京林業(yè)大學(xué)采用40～44 ℃的高溫和-2 ℃低溫的極端溫度的方法誘導(dǎo)毛新楊、銀毛楊（P. alba × P. tomentosa）、銀腺楊（P. alba × P. glandulosa）雌花芽，結(jié)果證明均可產(chǎn)生三倍體植株，并確定了處理雌花芽的最佳時(shí)期為水培的1～5d。后經(jīng)試驗(yàn)證明所獲三倍體植株具有較好的生長(zhǎng)勢(shì)。他們還利用40 ℃高溫處理雄花芽得到66.25%的2n花粉[26，27]。

1.3 自然環(huán)境下篩選

利用自然變異，優(yōu)中選優(yōu)是植物種質(zhì)改良的常用方法。在自然條件下，性母細(xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中由于受到外界條件的影響，染色體沒(méi)有被分到兩個(gè)細(xì)胞中去，致使在后期花粉受精后，得到了三倍體的后代。1992-1995年，康向陽(yáng)[28]對(duì)保留的無(wú)性系中長(zhǎng)勢(shì)較好的60株毛白楊優(yōu)良無(wú)性系進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)5株為三倍體，染色體數(shù)2n=3x=57，是國(guó)內(nèi)首次在自然界中發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)三倍體，為中國(guó)楊樹(shù)多倍體育種做出重要貢獻(xiàn)。通過(guò)大量篩選，雖然可從自然界直接獲取多倍體植株，但是這種變異發(fā)生概率極低，導(dǎo)致篩選的工作量較大，往往在實(shí)踐中不采用這種方式獲得多倍體。

1.4 不同倍性的楊樹(shù)雜交

不同倍性的楊樹(shù)雜交培育多倍體是獲得楊樹(shù)多倍體的常規(guī)思路，當(dāng)楊樹(shù)中存在不同倍性的可育植株時(shí)，直接通過(guò)雜交可以簡(jiǎn)單快捷地獲得多倍體。例如利用四倍體與二倍體雜交就有機(jī)會(huì)產(chǎn)生三倍體，操作簡(jiǎn)單，易于掌握，雜交后產(chǎn)生的后代的純合體，便于后續(xù)研究，但在雜交過(guò)程中由于雙方親本的倍性關(guān)系導(dǎo)致雜交可育性很低，獲得多倍體的數(shù)量少，因此不利于規(guī)?；N。

1992年，康向陽(yáng)等[16]用高溫處理?xiàng)顦?shù)花粉，得到2n花粉粒，然后與正常雌株雜交培育出三倍體。此后，李云等[27]采用極端溫度處理毛新楊、銀毛楊和銀腺楊誘導(dǎo)培育三倍體均取得成功。此種方式增加了2n配子的數(shù)量，從而提高了雜交后代三倍體的數(shù)量?？迪蜿?yáng)[28]采用人工加倍獲得銀腺楊與毛新楊的2n花粉，并對(duì)其進(jìn)行正交和反交，銀腺楊×毛新楊組合三倍體獲得率為3.8%；而毛新楊×銀腺楊組合則獲得12.9%的三倍體。經(jīng)栽培試驗(yàn)證明，獲得的兩種三倍體均有明顯的正向超親優(yōu)勢(shì)。李云等[29]還采用秋水仙素誘導(dǎo)毛新楊、銀腺楊、銀毛楊使其雌配子染色體加倍，然后采用正常的花粉授粉，獲得了種子并培育成苗，經(jīng)形態(tài)判斷和鏡檢成功選育13株三倍體植株，并在苗期具有明顯的速生性。此外研究發(fā)現(xiàn)響葉楊2n花粉的細(xì)胞學(xué)機(jī)制以后，采用高溫法使胚囊染色體加倍，然后授粉并以38 ℃的高溫處理，最后獲得三倍體誘導(dǎo)率高達(dá)83.33%[30]，并同時(shí)育出響葉楊四倍體，從而探索出了高效誘導(dǎo)楊樹(shù)三倍體的方法。

2 多倍體的鑒定

隨著多倍體育種技術(shù)的廣泛使用，多倍體鑒定技術(shù)也隨之發(fā)展。目前鑒定楊樹(shù)多倍體的方法有間接鑒定法和直接鑒定法。

2.1 間接鑒定法

間接鑒定法是通過(guò)楊樹(shù)形態(tài)觀察與二倍體進(jìn)行比較，通常楊樹(shù)多倍體具有葉片大而厚、葉柄粗而長(zhǎng)、葉綠體多、氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞大、纖維細(xì)胞增長(zhǎng)等特征，可以初步判斷所獲得植株是多倍體[13]。楊樹(shù)多倍體的發(fā)現(xiàn)就是在天然的條件下，其表現(xiàn)出巨大性而引起了研究者的注意，所以間接地通過(guò)性狀對(duì)楊樹(shù)多倍體鑒定是有一定依據(jù)的，可以方便快捷地在眾多材料中進(jìn)行初篩。張友鵬等[31]利用氣孔間接鑒定法鑒定誘導(dǎo)的多倍體楊樹(shù)。而國(guó)內(nèi)其他學(xué)者在鑒定白楊雜種三倍體時(shí)提出根據(jù)苗期葉片形狀、葉緣鋸齒形、葉尖和葉基、主脈與葉基側(cè)脈夾角等形態(tài)指標(biāo)初步鑒定三倍體的技術(shù)方法[32]。

近年來(lái)出現(xiàn)的流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry， FCM）是一種對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子從功能水平升高進(jìn)行細(xì)胞倍性檢測(cè)和分析的手段。該手段可以快速地分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，因其方便、快捷、獲取數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，已經(jīng)逐漸成為該領(lǐng)域的重要技術(shù)之一[12]。北京林業(yè)大學(xué)已成功地將流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于黑楊派和青楊派多倍體的鑒定中[33，34]。婁玲玲等[35]用大青楊為親本，雌花序授粉后施加0.2%～0.6%的秋水仙素，成功培育出大青楊同源三倍體，表現(xiàn)出有別于親本的優(yōu)良性狀，并通過(guò)染色體鏡檢和流式細(xì)胞術(shù)法進(jìn)行了鑒定。流式細(xì)胞儀有其他方法無(wú)法比擬的優(yōu)越性，例如檢測(cè)速度快，可獲得多重?cái)?shù)據(jù)，不使用同位素，無(wú)放射性污染等。但也有其不足之處，例如價(jià)格高昂，檢測(cè)費(fèi)用高，儀器操作復(fù)雜，材料需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，否則會(huì)因?yàn)椴环€(wěn)定而導(dǎo)致數(shù)據(jù)失真等。此外，王君等[36]提出利用細(xì)胞間期染色中心數(shù)目的最大染色體數(shù)目對(duì)三倍體進(jìn)行鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，并用該法對(duì)青楊派楊樹(shù)倍性進(jìn)行了鑒定。他們指出，中心數(shù)目大于40且小于60的植株鑒定為三倍體，大于60的鑒定為四倍體。此方法大大提高了倍性鑒定的效率，且多試驗(yàn)材料要求不高。但是直接通過(guò)性狀判斷楊樹(shù)多倍體存在著可靠性低、不準(zhǔn)確的特點(diǎn)，僅通過(guò)表現(xiàn)性狀鑒定具有很大的偶然性。表現(xiàn)型是通過(guò)基因和環(huán)境共同決定的，例如后天環(huán)境適于生長(zhǎng)可能會(huì)表現(xiàn)出葉片大、葉柄粗、葉片顏色深等近似多倍體的特點(diǎn)，實(shí)際上多倍體楊樹(shù)也存在性狀上不及二倍體的現(xiàn)象，這就為間接鑒定帶來(lái)了難度。在實(shí)際的鑒定中，一般采用兩種或兩種以上的方法，這樣可以保證鑒定的準(zhǔn)確性。有學(xué)者對(duì)于氣孔密度單一指標(biāo)的可靠性較低問(wèn)題提出了解決方案，指出綜合利用氣孔密度和氣孔面積兩個(gè)參數(shù)可以較準(zhǔn)確地鑒定青楊派三倍體[33]。

2.2 直接鑒定法

楊樹(shù)多倍體的直接鑒定，即直接觀察染色體的數(shù)目，該鑒定途徑最為可靠。

染色體計(jì)數(shù)法對(duì)材料有較高要求，一般選取楊樹(shù)幼嫩莖尖或幼葉為材料，經(jīng)解離、漂洗、染色、制片進(jìn)行觀察?？迪蜿?yáng)等[28]在0.2%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羧基喹啉溶液中預(yù)處理3～5 h，然后轉(zhuǎn)入0.075 mol/L KCl溶液低滲處理0.5 h，洗滌，加入纖維素酶和果膠酶酶解3 h，洗滌，加入卡諾固定液，用鑷子將材料搗碎，再加入卡諾固定液制成細(xì)胞懸液，然后制片，觀察到明顯的棒狀結(jié)構(gòu)的染色體。陳杰[24]利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)獲得四倍體滇楊，并通過(guò)形態(tài)特征、染色體數(shù)量以及氣孔大小對(duì)多倍體進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果證明秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)的方式對(duì)于楊樹(shù)多倍體誘導(dǎo)具有很好的效果，他們發(fā)現(xiàn)，誘變后的植株與二倍體相比，染色體數(shù)目增加到了76條。

此類多倍體鑒定方法的特點(diǎn)是能比較直觀地判斷倍性關(guān)系，試驗(yàn)器材簡(jiǎn)單，試驗(yàn)易于進(jìn)行，是目前仍較為廣泛使用的多倍體方法。但二倍體楊樹(shù)染色體數(shù)較多（2n=2X=38），對(duì)其加倍后染色體形態(tài)及數(shù)目就更不易鑒定。因此，建立高效穩(wěn)定的染色體制片技術(shù)是利用該方法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定的前提。

3 問(wèn)題及建議

楊樹(shù)多倍體育種是目前較為有效的楊樹(shù)遺傳改良手段，現(xiàn)已在楊樹(shù)新種質(zhì)創(chuàng)育方面取得了一定的成就。但在育種過(guò)程中仍存在著一些理論及方法上的問(wèn)題。

3.1 秋水仙素誘導(dǎo)的結(jié)果

秋水仙素是目前誘導(dǎo)效果最好的誘變劑。但也存在著一些不足之處，秋水仙素適用于獲取同源偶數(shù)倍性體，理論上是由二倍體誘導(dǎo)為四倍體。但康向陽(yáng)等[16]以銀腺楊為母本，毛白楊為父本進(jìn)行授粉，并用秋水仙素處理，意外獲得了白楊三倍體植株，其作用機(jī)理仍不清楚。采用秋水仙素等誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，得到三倍體還是四倍體仍無(wú)法預(yù)測(cè)。因此，需進(jìn)一步對(duì)秋水仙素誘變的相關(guān)機(jī)理進(jìn)行更深層的研究，以提高誘變效果的可預(yù)見(jiàn)性。

3.2 2n花粉的誘導(dǎo)

采用2n花粉粒雜交選育三倍體過(guò)程中，2n花粉粒誘導(dǎo)率低，在處理花粉粒時(shí)，處理時(shí)機(jī)難以掌握[37]，給誘導(dǎo)處理帶來(lái)了很大的障礙。而且得到2n花粉粒在雜交過(guò)程中要克服單性花粉的競(jìng)爭(zhēng)，往往導(dǎo)致成功率較低。所以，今后需要加大力度，重點(diǎn)解決如何高效誘導(dǎo)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)的2n花粉，以提高多倍體的得率。

3.3 嵌合體的分離

不論是通過(guò)秋水仙素處理種子、頂芽，還是秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)進(jìn)行多倍體材料的誘導(dǎo)，均存在產(chǎn)生一定量嵌合體的現(xiàn)象。嵌合體在后期大多會(huì)恢復(fù)為正常二倍體。因此，需要建立快速有效的初篩方法（例如分子標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)等），并利用楊樹(shù)易于無(wú)性繁殖的特性，在早期對(duì)嵌合體中的誘變部分進(jìn)行分離，并通過(guò)嫁接、扦插及組織培養(yǎng)等手段將其多倍化性狀加以固定。

3.4 后續(xù)工作的堅(jiān)持

育種工作取得的成功，不僅僅是在前人已有工作基礎(chǔ)上進(jìn)行的繼續(xù)研究，而是對(duì)自己前期工作的持之以恒。尤其對(duì)生命周期較長(zhǎng)的林木來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作需時(shí)更長(zhǎng)。通過(guò)染色體加倍獲得的楊樹(shù)多倍體材料，要經(jīng)過(guò)多年無(wú)性系測(cè)定，依育種目標(biāo)多代選擇，其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定性才能最終被確認(rèn)。因此，需要楊樹(shù)育種工作者兢兢業(yè)業(yè)，堅(jiān)持不懈地完成這項(xiàng)工作，切忌急于求成，半途而廢。只有這樣，才能最終取得成功，選育出新的優(yōu)良楊樹(shù)品種。

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