楊勝遠+韋錦+李卓文等

摘要：針對副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在低溫條件下容易進入不可培養(yǎng)狀態(tài)，難以保藏的問題，通過平板菌落計數(shù)法對副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏條件進行了探討。結(jié)果表明，NaCl對副溶血性弧菌4 ℃保藏有保護作用，其中以45 g/L NaCl保護效果最佳，而且45 g/L NaCl不影響副溶血性弧菌的生長。將副溶血性弧菌細胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培養(yǎng)基培養(yǎng)后直接于4 ℃保藏，保藏90 d，活細胞數(shù)僅由109下降到106。

關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；甘油；培養(yǎng)基；NaCl

中圖分類號：TS207.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4395-04

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性細菌，廣泛存在于世界各國的沿海地區(qū)，隸屬于弧菌科弧菌屬，是食源性疾病的重要病原菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物食物中毒的首位[1，2]。為了控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病，國內(nèi)外學者已對副溶血性弧菌的檢測、預測模型及風險評估、群體感應、防控方法、致病機理等領(lǐng)域研究給予了極大關(guān)注[3–11]。然而，由于副溶血性弧菌在低溫條件下很容易進入不可培養(yǎng)狀態(tài)[12，13]，采用常規(guī)的斜面或半固體培養(yǎng)基在4 ℃冰箱保藏的時間很短，通常4 ℃保藏15～30 d已無法通過國家標準GB/T 4789.7–2013的3%氯化鈉堿性蛋白胨水培養(yǎng)基[14]或TCBS瓊脂培養(yǎng)基活化。一些研究或檢驗機構(gòu)為了保藏副溶血性弧菌標準菌株，常采用室溫保藏或-80 ℃冷凍保藏。

雖然室溫保藏成本低，但是需要經(jīng)常轉(zhuǎn)接活化，不斷傳代容易發(fā)生菌種變異，難以滿足菌種保藏“在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂”的基本要求；副溶血性弧菌是病原菌，需要執(zhí)行雙人雙鎖管理，頻繁的轉(zhuǎn)接菌種和培養(yǎng)操作，增加了菌種保藏和安全防護的工作量。-80 ℃冷凍保藏可以抑制副溶血性弧菌的代謝，菌種不易發(fā)生變異，但是超低溫冰箱價格貴，能耗高，普通實驗室無法滿足保藏條件，而且菌種使用前需解凍，使用不便，反復凍融操作還會導致菌種死亡。普通冰箱價格相對便宜，一般實驗室均具備，因此如能解決副溶血性弧菌在低溫條件下易進入不可培養(yǎng)狀態(tài)的問題，實現(xiàn)4 ℃冰箱保藏將對相關(guān)的研究和檢驗工作具有極大的推動作用。本研究旨在對副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏條件進行研究，探尋一種方便的副溶血性弧菌短期保藏方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）CP1由廣東海洋大學孫力軍教授惠贈。

試劑：TCBS瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為市售國產(chǎn)生化試劑或分析純試劑。

儀器：LRH-250型恒溫培養(yǎng)箱，上海-恒科學儀器有限公司；HZQ-X100型恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱，太倉市實驗設備廠；VX-200型漩渦混合儀，美國Labnet公司。

培養(yǎng)基：30 g/L氯化鈉堿性蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基（Alkaline Peptone Water Agar， APWA）及30 g/L氯化鈉堿性蛋白胨水（Alkaline Peptone Water， APW）參照文獻[14]進行配制，其中APWA培養(yǎng)基的瓊脂用量改為10 g/L，APW培養(yǎng)基只對氯化鈉濃度進行相應調(diào)整。

1.2 試驗方法

1.2.1 副溶血性弧菌的培養(yǎng) 從副溶血性弧菌斜面挑取1環(huán)菌苔接入裝有100 mL 30 g/L NaCl-APW 培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)12 h，作為種子液和保藏所需的培養(yǎng)液。

1.2.2 副溶血性弧菌計數(shù) 取待測樣品1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋渦混勻，記為10-1；取10-1稀釋液1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋渦混勻，記為10-2；如此依次進行10倍梯度稀釋至10-8。分別取適宜稀釋度的稀釋液1 mL于無菌培養(yǎng)皿中，傾注冷卻到50 ℃左右的30 g/L NaCl-APWA培養(yǎng)基15 mL，混勻、靜置凝固，于37 ℃倒置培養(yǎng)18 h，進行菌落計數(shù)。每個稀釋度重復3塊平板，取平均值作為該稀釋度的菌落總數(shù)。

1.2.3 不同保護劑對副溶血性弧菌保藏的影響 將副溶血性弧菌培養(yǎng)液分別與無菌水、無菌30 g/L NaCl溶液、無菌40 g/L甘油水溶液、無菌30 g/L NaCl-40 g/L甘油復合溶液按體積比1∶1進行混合，再用漩渦混合儀充分混勻，然后分裝2 mL無菌Eppendorf離心管，加蓋密閉作為保藏管。分為3組，分別置于25、4 、-20 ℃下保藏，定時取樣測定副溶血性弧菌數(shù)。

1.2.4 NaCl濃度對副溶血性弧菌保藏的影響 將副溶血性弧菌培養(yǎng)液分別與10、20、30、40、50、60、70 g/L的無菌NaCl溶液按體積比1∶1進行混合并用漩渦混合儀充分混勻，然后分裝2 mL無菌Eppendorf離心管，加蓋密閉作為保藏管，置于4 ℃保藏，定時取樣測定副溶血性弧菌數(shù)。均設3個平行試驗。由于原培養(yǎng)基含有30 g/L NaCl，因此混合液的NaCl終濃度理論值分別為20、25、30、35、40、45、50 g/L。

1.2.5 NaCl濃度對副溶血性弧菌生長的影響 分別取5 mL副溶血性弧菌種子液接入含NaCl濃度分別為30、35、40、45、50 g/L的APW培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后測定各培養(yǎng)液副溶血性弧菌數(shù)。

1.2.6 副溶血性弧菌4 ℃保藏條件驗證 分別取1 mL副溶血性弧菌種子液接入45 g/L NaCl-APW培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后置于4 ℃冰箱保藏，間隔30 d取樣測定副溶血性弧菌數(shù)；從副溶血性弧菌斜面挑取1環(huán)菌苔于45 g/L NaCl-APWA斜面，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，加入5 mL無菌45 g/L NaCl溶液覆蓋斜面的菌苔，然后置于4 ℃冰箱保藏，間隔30 d搖勻后用接種環(huán)隨機沾取菌懸液1環(huán)于45 g/L NaCl-APWA斜面和TCBS斜面進行劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，定性觀察副溶血性弧菌數(shù)生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護劑對副溶血性弧菌保藏的影響

不同保護劑對副溶血性弧菌保藏的影響見圖1。由圖1可知，加無菌水和30 g/L NaCl 25 ℃保藏較4 ℃和-20 ℃保藏殘存的副溶血性弧菌活菌數(shù)高，但由于副溶血性弧菌在25 ℃仍處于旺盛的代謝繁殖狀態(tài)，在保藏過程中一直處于不斷分裂，傳代次數(shù)越多，菌種發(fā)生變異的幾率也越大，因此仍以低溫保藏更具價值。圖1顯示，4 ℃和-20 ℃低溫保藏條件下，加無菌水組的細胞存活率非常低，而加30 g/L NaCl組的細胞存活率較高，保藏30 d，殘存活菌數(shù)仍可達到107。結(jié)果表明，一定濃度的NaCl有利于減緩副溶血性弧菌的冷傷害。

甘油常作為菌種冷凍保藏的冷凍保護劑，添加40 g/L甘油和30 g/L NaCl-40 g/L甘油復合溶液的試驗組結(jié)果顯示，甘油對副溶血性弧菌影響很大，25 ℃保藏30 d已檢測不到活菌，雖然4 ℃和-20 ℃保藏30 d仍有副溶血性弧菌存活，但殘存活菌數(shù)很低，已由原來的108下降到103。從方便使用和短期保藏的角度考慮，選擇NaCl作為保護劑，對副溶血性弧菌4 ℃保藏條件進行進一步探討。

2.2 NaCl濃度對副溶血性弧菌保藏的影響

由圖2可知，4 ℃保藏條件下，保藏菌液NaCl終濃度對副溶血性弧菌影響較大。當NaCl濃度低于45 g/L，隨著NaCl濃度的增加，副溶血性弧菌的存活細胞數(shù)也增加；當NaCl濃度超過45 g/L，副溶血性弧菌的存活細胞數(shù)呈下降趨勢。當NaCl終濃度為45 g/L時，保藏效果最佳，保藏30、60、90 d副溶血性弧菌的存活細胞數(shù)分別達到107、106和105。因此，選擇保藏菌液的NaCl終濃度為45 g/L較為適宜。

2.3 NaCl濃度對副溶血性弧菌生長的影響

圖2已表明保藏菌液的NaCl終濃度為45 g/L時有利于副溶血性弧菌4 ℃保藏，圖3對不同濃度NaCl對副溶血性弧菌生長的影響進行了探討，結(jié)果表明，當APW培養(yǎng)基的NaCl濃度在30～50 g/L范圍內(nèi)，副溶血性弧菌均生長良好。因此，結(jié)合圖2和圖3的結(jié)果，選擇45 g/L NaCl-APW作為培養(yǎng)基對副溶性血孤菌進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后直接置于4 ℃進行保藏即可。

2.4 副溶血性弧菌4 ℃保藏條件驗證

從圖4可見，采用45 g/L NaCl-APW培養(yǎng)基培養(yǎng)后直接置于4 ℃冰箱進行保藏，保藏90 d，副溶血性弧菌的存活細胞數(shù)僅由109下降到106。

采用45 g/L NaCl溶液覆蓋斜面的菌苔，于4 ℃保藏90 d，以接種環(huán)沾取菌懸液劃線接種，結(jié)果保藏的菌種在TCBS斜面和45 g/L NaCl-APWA斜面上均生長良好。

驗證結(jié)果表明，將副溶血性弧菌細胞置于45 g/L NaCl溶液或含45 g/L NaCl的培養(yǎng)基中進行4 ℃保藏，可有效防止低溫對細胞的冷傷害，4 ℃保藏可達90 d。

3 小結(jié)與討論

甘油對副溶血性弧菌有副作用，不宜作為副溶血性弧菌的冷凍保藏的保護劑。NaCl對副溶血性弧菌4 ℃保藏有保護作用，其中以45 g/L NaCl保護效果最佳，而且45 g/L NaCl不影響副溶血性弧菌的生長。將副溶血性弧菌細胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后直接于4 ℃保藏，可有效防止低溫對細胞的冷傷害，保藏90 d，副溶血性弧菌活菌數(shù)僅由初始的109下降至106。副溶血性弧菌4 ℃保藏具體方法可通過2種方式實現(xiàn)：①先以45 g/L NaCl-APWA斜面培養(yǎng)，再以5 mL 45 g/L無菌NaCl溶液覆蓋，然后置于4 ℃保藏；②以45 g/L NaCl-APW液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取出直接4 ℃保藏。其中以②保藏法更為方便。

4 ℃斜面菌種保藏法具有方法簡便、使用方便、條件容易實現(xiàn)等優(yōu)點，已成為菌種短期保藏常用的方法，然而副溶血性弧菌斜面于4 ℃保藏15～30 d，副溶血性弧菌就因發(fā)生菌種死亡或轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢膳囵B(yǎng)狀態(tài)而難以再活化，實際工作中往往造成研究中斷或需要反復購買標準菌株，菌種保藏難的這一問題一直困擾著研究和檢驗人員。本研究表明，NaCl濃度對副溶血性弧菌影響較大，以含45 g/L NaCl的液體保藏方式，4 ℃可保藏3個月。該方法簡便，可以通過以45 g/L NaCl-APW液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后取出置于4 ℃保藏或以45 g/L無菌NaCl溶液覆蓋副溶血性弧菌斜面后置于4 ℃保藏2種簡便方法實現(xiàn)低溫保藏，該法可供研究和檢驗人員借鑒。

甘油是菌種冷凍保藏的常用冷凍保護劑，已為廣大學者普遍認同，然而本研究發(fā)現(xiàn)甘油對副溶血性弧菌的存活影響很大，無論是室溫、4 ℃或-20 ℃保藏條件下，甘油都對副溶血性弧菌的存活均不利，其原因有待進一步研究。

本研究主要從副溶血性弧菌的存活角度進行研究，解決了4 ℃保藏條件下菌種的存活問題，但4 ℃保藏條件是否對副溶血性弧菌的毒力或生化生理性質(zhì)有影響，尚需進一步研究。

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