張 楠，包海鷹

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118)

鵝膏菌是一個(gè)世界性分布的大屬，有毒蘑菇中最重要的一類。目前已定名的約有500多種[1]。屬于擔(dān)子菌亞門 (Basidiomycotina)、層菌綱 (Hymenomycetes)、傘菌目 (Agaricales)、鵝膏科 (Amanitaceae)、鵝膏屬 (Amanita Pers.:Gray)[2]。鵝膏菌中主要的毒素為肽類毒素，共有3大類22種，分別為鵝膏毒肽 (Amatoxins)9種、鬼筆毒肽 (Phallotoxins)7種和毒傘素 (Vrotoxins)6種。肽類毒素由于獨(dú)特的生物學(xué)特性，目前廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、基因工程，病毒等研究領(lǐng)域[3－5]。由于鵝膏屬大多數(shù)與針科或殼斗可形成外生菌根菌[6]，尚無人工栽培。國(guó)內(nèi)毒素來源美國(guó)Sigma公司，每毫克價(jià)格在1.2×105美元～1.4×105美元。

因?yàn)轾Z膏屬在真菌中的關(guān)鍵性地位以及其毒素的特殊性，人工培養(yǎng)鵝膏菌的努力從來沒有停止過。為了更方便地研究鵝膏菌，人工純培養(yǎng)正在逐步成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[7]。

依據(jù)包海鷹教授多年來對(duì)長(zhǎng)白山產(chǎn)鵝膏屬真菌的調(diào)查研究，以及對(duì)7種長(zhǎng)白山產(chǎn)鵝膏屬真菌肽類毒素的高效液相分析[8，9]，發(fā)現(xiàn)了玫瑰紅鵝膏 A.pallidorosea，其具有資源豐富、毒素含量高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)玫瑰紅鵝膏進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的肽類毒素進(jìn)行分離提取，研究其藥理活性，為毒素獲得提供新的資源，進(jìn)一步豐富了鵝膏毒肽藥理作用方面的研究?jī)?nèi)容。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玫瑰紅鵝膏Amanita pallidorosea，采自吉林省輝南縣朝陽鎮(zhèn)樣子哨。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀;色譜分析柱:分析柱YWG－C18柱 (150 mm×4.6 mm，10 μm)，北京分析儀器廠，半制備柱 VenusⅡ MP－C18柱 (250 mm ×10 mm，10 μm)，Agela Technologies;二氧化碳培養(yǎng)箱，NAPCO法國(guó);離心機(jī)SORVALL;電子分析天平，SHIMADZU－AUY220型。

1.2.2 試劑

醋酸銨 (美國(guó)Sigma公司);乙腈和甲醇 (色譜純);冰醋酸和石油醚 (分析純);洗脫液A相:10%乙腈和90%0.02 mol·L－1醋酸銨，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0;洗脫液B相:30%乙腈和70%濃度0.02 mol·L－1醋酸銨，冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0;純凈水 (杭州娃哈哈公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:a－鵝膏毒肽 (a－AMA)、β－鵝膏毒肽 (β－AMA)、二羥鬼筆毒肽 [Phalloidin(PHD)]，以上3種標(biāo)準(zhǔn)品均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所提供。

1.3 液體深層培養(yǎng)方法

1.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (改良PDM)

馬鈴薯 200 g·L－1、葡萄糖 20 g·L－1、磷酸二氫鉀3 g·L－1、硫酸鎂 0.5 g·L－1、磷酸氫氨 0.5 g·L－1、氯化鈣0.05 g·L－1、硝酸鉀 0.1 g·L－1、麥芽汁 (12 波美度)120 mL、VB10.01 g·L－1。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

斜面菌種于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d后，將適量菌絲接入最適培養(yǎng)基中，然后置于恒溫振蕩器上，150 r·min－1振蕩培養(yǎng)10 d。

搖瓶發(fā)酵:250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液，接種量5%(v·v－1)，置于 26℃恒溫振蕩器上，150 r·min－1振蕩培養(yǎng) 25 d。取25 d的發(fā)酵菌絲體，于烘箱中60℃烘至恒重，電子天平稱重并記錄。

1.3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì) (Box－Benhnken)法，對(duì)溫度 (A)、pH值 (B)和轉(zhuǎn)速 (C)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。各因素及其編碼水平的設(shè)計(jì)見表1。

表1 中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)的變量及水平

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物中肽類毒素的檢測(cè)

1.4.1 粗毒液的制備

菌種培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液過濾，收集濾渣和濾液，把菌絲體在60℃下烘干后研磨。取1 g研磨后的菌絲體粉末，溶于10 mL 50%甲醇中，室溫下振蕩抽提24 h，8 000 r·min－1離心收集上清液。沉淀以10 mL 50%甲醇室溫下振蕩抽提24 h，8 000 r·min－1離心收集并合并上清液。用石油醚去脂2次，然后冷凍干燥，凍干的樣品用超純水溶解，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到鵝膏粗毒液。

1.4.2 HPLC測(cè)定參數(shù)

使用安捷倫1100高效液相色譜儀分離梯度模式為:0→15 min，B 0→5%，A 100%→95%;15 min→35 min，B 5%→80%，A 95%→20%;35 min→40 min，B 80%，A 20%;40 min→45 min，B80%→100%，A20%→0%;45 min→50 min，B 100%;50 min→55 min，B 100%→0%，A 0→100%并保持10 min。純化梯度模式:與分離梯度模式相同。檢測(cè)波長(zhǎng):295 nm;柱溫:40℃;流速:分析柱1 mL·min－1;半制備柱:2 mL·min－1。進(jìn)樣量:分析柱 10 μL，半制備柱 1 mL。

1.4.3 HPLC分離純化

先在分析柱上篩選出最適宜的色譜條件，后在半制備柱上進(jìn)行毒素的分離和純化，得到2種化合物。冷凍干燥后，用高效液相進(jìn)行檢測(cè)。分離純化結(jié)果用Finnigan－MAT.LCQ電噴霧質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

1.5 對(duì)植物病原菌的抑制活性

1.5.1 供試病原真菌

香瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，菌種由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所提供。

1.5.2 指示菌的培養(yǎng)

首先將試管斜面保存的菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，等菌種長(zhǎng)好后，用直徑7 mm的打孔器制成菌塊。

1.5.3 供試品對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

采用生長(zhǎng)速率法[10－12]。取質(zhì)量濃度為 105 μg·mL－1的粗提物溶液200 μL，混合于100 mL的PDA培養(yǎng)基中，配制以下濃度的含毒培養(yǎng)基，即玫瑰紅鵝膏子實(shí)體粗毒液:200 μg·mL－1[13]、100 μg·mL－1、50 μg·mL－1;發(fā)酵產(chǎn)物:800 μg·mL－1、400 μg·mL－1、200 μg·mL－1;不添加任何供試品的平板培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將已制好的菌塊接種于含毒的平板培養(yǎng)基中，置于26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。然后，用十字交叉法測(cè)抑菌率 (%)，公式為:

式中:R1為對(duì)照菌落直徑;R2為處理菌落直徑。

1.5.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用x±SD表示。p＜0.05說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈顯著差異，p＜0.01說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈極顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體深層培養(yǎng)

2.1.1 不同溫度對(duì)菌絲體重量的影響

設(shè)置20℃、23℃、26℃、30℃、33℃、36℃共計(jì)5個(gè)不同的溫度處理 (溫度變幅為±1℃)，結(jié)果見圖1。

結(jié)果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在26℃下培養(yǎng)，菌絲體干物質(zhì)重量最高，生長(zhǎng)狀態(tài)最好。當(dāng)溫度達(dá)到33℃時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)極其緩慢，當(dāng)溫度達(dá)到36℃時(shí)，菌絲體基本停止生長(zhǎng)?？赡軠囟冗^高會(huì)導(dǎo)致菌體內(nèi)的酶活性降低或者喪失。

2.1.2 不同pH值對(duì)菌絲體重量的影響

設(shè)置4、5、6、7、8共計(jì)5個(gè)不同的 pH值處理。用1 mol·L－1的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在pH值為6的條件培養(yǎng)時(shí)，菌絲體干物質(zhì)重量最高。

2.1.3 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體重量的影響

設(shè)置 80 r·min－1、100 r·min－1、120 r·min－1、140 r·min－1、160 r·min－1共計(jì)5個(gè)不同的轉(zhuǎn)速處理，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在140 r·min－1振蕩培養(yǎng)時(shí)，菌絲體干物質(zhì)重量最高。

2.1.4 Box－Benhnken實(shí)驗(yàn)分析

中心組合旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 中心組合旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

本試驗(yàn)以玫瑰紅鵝膏菌絲體干重 (g)為響應(yīng)變量，以溫度 (A)、pH值 (B)和轉(zhuǎn)速 (C)為影響因子，進(jìn)行 Box－Behnken響應(yīng)面分析，利用統(tǒng)計(jì)軟件SAS8.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可建立二次回歸方程 (編碼后):

Y=+1.00－0.018×A+0.020×B+0.068×C+0.052×A×B+5.500E－003×A×C+0.055×B×C－0.15×A2－0.16×B2－0.061×C2，相關(guān)系數(shù) R2=99.67%，修正相關(guān)系數(shù) R2Adj=99.24%。

對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 二次回歸方程方差分析表

回歸模型達(dá)到極顯著水平 (p＜0.01)而誤項(xiàng)不顯著，說明回歸方程與實(shí)際情況較吻合，試驗(yàn)誤差小，因此可利用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，模型的一次項(xiàng)A、B、C極顯著;二次項(xiàng)均極顯著;交互項(xiàng)AB、BC極顯著，AC不顯著。這表明各種因素對(duì)于菌絲體重量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.1.5 因素間的交互作用

根據(jù)回歸方程并利用Design－Expert軟件作不同因素的響應(yīng)面分析圖和等高線圖，溫度、pH值和轉(zhuǎn)速三因素及其交互作用對(duì)菌絲體重量的影響結(jié)果通過圖4～圖6直接反應(yīng)出來。

結(jié)果表明，等高線的形狀可以反映出因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素間的交互效應(yīng)不顯著，橢圓形表示顯著。

2.1.6 玫瑰紅鵝膏發(fā)酵條件的優(yōu)化與結(jié)果驗(yàn)證

對(duì)方程Y=+1.00－0.018×A+0.020×B+0.018×C+0.052×A×B+5.500E－003×A×C+0.055×B×C－0.15×A2－0.16×B2－0.061×C2，最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度25℃、pH值6、轉(zhuǎn)速為156 r·min－1，其所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重為1.034 g。

2.1.7 回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)條件對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重均值為1.054 g，優(yōu)化后提高了1.02倍，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的誤差為+2.8%。表明響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰紅鵝膏最佳培養(yǎng)條件是有效可行的。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中肽類毒素的檢測(cè)

將菌絲體粗提物液通過液相進(jìn)行分離純化。液相保留時(shí)間，因不同的分離條件和不同的色譜柱，保留時(shí)間有一定的差異，但是各個(gè)化合物在液相上的出峰順序保持不變。同時(shí)根據(jù)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和內(nèi)標(biāo)法確定化合物，得到2個(gè)化合物，但是其含量較低?；衔?在分析柱上檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。

檢測(cè)化合物1保留時(shí)間是11.41 min，純度較高。電噴霧質(zhì)譜[M+Na]峰是941，MW是918(圖8)。根據(jù)色譜保留時(shí)間和分子量，判斷組分為α－鵝膏毒肽 (α－AMA)，分子式為C39H54N10O14S。

化合物2在分析住上檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，檢測(cè)化合物2保留時(shí)間是7.92 min。電噴霧質(zhì)譜 [M－H]峰是918，MW是919(圖10)。根據(jù)色譜保留時(shí)間和分子量，判斷組分為β－鵝膏毒肽 (β－AMA)，分子式C39H53N9O15S。

2.3 對(duì)植物病原菌的抑制活性

2.3.1 玫瑰紅鵝膏子實(shí)體粗毒液對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用

玫瑰紅鵝膏子實(shí)體粗毒液對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用見表4。

表4 玫瑰紅鵝膏子實(shí)體粗毒液對(duì)香瓜枯萎病菌抑制作用 (n=3)

由表4可以看出，鵝膏粗毒液對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關(guān)系。濃度為 200 μg·mL－1時(shí)抑制率最高，為42.47%，100 μg·mL－1時(shí)作用力次之，50 μg·mL－1時(shí)抑制率最低，且與空白組對(duì)比呈極顯著差異 (p＜0.01)。

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用

發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用見表5。

表5 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用 (n=3)

由表5可知，發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關(guān)系。濃度為800 μg·mL－1時(shí)抑制率最高，為 21.29%;400 μg·mL－1時(shí)作用力次之，且與空白組對(duì)比呈極顯著差異(p ＜0.01);200 μg·mL－1時(shí)抑制率為 0。

3 討論

經(jīng)過響應(yīng)面方法優(yōu)化，獲得了最佳培養(yǎng)條件，即溫度為25℃，pH值為6，轉(zhuǎn)數(shù)為156 r·min－1。此培養(yǎng)條件更適合玫瑰紅鵝膏菌絲體的生長(zhǎng)。同時(shí)，在其發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到2種毒素α－AMA和β－AMA。但是毒素含量較低，如何提高發(fā)酵產(chǎn)物中的毒素含量有待于更進(jìn)一步的研究。

玫瑰紅鵝膏子實(shí)體粗毒液和發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)香瓜枯萎病菌有不同的抑制作用。當(dāng)子實(shí)體濃度為200 μg·mL－1時(shí)抑制率最高，為42.47%。可能是肽類毒素對(duì)植物病原菌有抑制作用，因?yàn)槊倒寮t鵝膏子實(shí)體粗毒液和發(fā)酵產(chǎn)物中的肽類毒素的含量不同，造成了抑菌效果的差異。鵝膏肽類毒素影響真菌細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶Ⅱ的活性，進(jìn)而抑制了真菌細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的合成，繼而阻礙了蛋白質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡[14，15]。其作為新型的生物農(nóng)藥有待于更進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。

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