秦 斌，郭曉燕，董 蕾，戴 菲，趙菊輝，李 路

(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710004;*通訊作者，E-mail:dong556@126.com)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是常見的功能性胃腸疾病之一，表現(xiàn)為腹痛，腹部不適及排便性狀的改變，發(fā)病原因尚不明確。參與IBS發(fā)生的可能病理生理過程包括內(nèi)臟敏感性增高、腦腸軸功能改變、精神心理因素、腸道炎癥等［1］。肥大細胞作為免疫細胞貯存和分泌多種生物活性介質(zhì)，包括組胺、5－羥色胺、前列腺素、P物質(zhì)和細胞因子等，通過調(diào)節(jié)腸黏膜的局部免疫及黏膜通透性參與IBS的發(fā)生［2］。大量研究證實肥大細胞在IBS患者結(jié)腸黏膜中數(shù)目發(fā)生改變，但結(jié)果不一。多項研究證實在腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)患者腸道中肥大細胞計數(shù)明顯高于正常人［3，4］，且肥大細胞脫顆粒產(chǎn)物組胺、白介素等水平增高［5］。但肥大細胞計數(shù)與臨床癥狀的相關(guān)性尚無統(tǒng)一結(jié)論。因此本實驗通過研究肥大細胞與IBS臨床癥狀的相關(guān)性以探討肥大細胞的可能作用。

1 資料與方法

1.1 對象與材料

根據(jù)功能性胃腸疾病羅馬Ⅲ診斷標準選取2011－10～2013－12西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門診腹瀉型IBS患者34例，健康對照15例。納入標準:無消化道癥狀及體征;既往有結(jié)腸息肉內(nèi)鏡切除史或結(jié)直腸癌家族史;要求行結(jié)腸鏡檢查。排除標準:過敏性疾病(哮喘，過敏性紫癜等);近期腸道感染病史或其他部位感染病史;嚴重系統(tǒng)疾病;2周內(nèi)有服藥史。

PENTAX電子腸鏡由西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科提供;人肥大細胞類胰蛋白酶(MCT)抗體購自Abcam公司，TRITC標記的熒光二抗購自中杉金橋公司，DAPI染劑購自Sigma公司。MCT酶聯(lián)免疫試劑盒購自美國R＆D公司，熒光染色圖像采集使用NikonECLPSE TE2000－U系統(tǒng)。所有研究對象均知情同意，并且本研究獲得西安交通大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 患者癥狀評分及取材

IBS患者均行腹痛程度評分，評分標準:0分為無腹痛癥狀;1分為腹痛輕微，不影響日?；顒?2分為腹痛較輕，需要費勁才能忽視，日?；顒由胁恍枰{(diào)整;3分為腹痛較重，日?；顒邮苡绊懬倚枰{(diào)整;4分為腹痛嚴重，不能參加日?；顒?。并記錄其他臨床信息。所有的研究對象均進行結(jié)腸鏡檢查。內(nèi)鏡下無陽性表現(xiàn)者在距離肛門20－30 cm的乙狀結(jié)腸取活檢組織4塊，迅速置于液氮后放入－70℃冰箱保存。

1.3 肥大細胞計數(shù)

取1塊腸結(jié)腸黏膜標本立即用10%甲醛固定8 h后置于30%蔗糖溶液4－6 h，OCT膠包埋后于冰凍切片機上切片，切片厚度為5μm。采用間接免疫熒光法對腸黏膜類胰蛋白酶進行染色，MCT一抗孵育過夜后加入熒光二抗37℃孵育1 h。隨機連續(xù)計數(shù)3個高倍視野(400倍)內(nèi)MC數(shù)量，取平均值。為確定MCT細胞內(nèi)定位，二抗孵育結(jié)束后加入DAPI染液約3 min。

1.4 類胰蛋白酶含量測定

3塊腸黏膜活檢標本稱重后、生理鹽水里漂洗、在2 ml Hank平衡鹽溶液置于37℃下孵育1 h，離心后取50μl上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定類胰蛋白酶水平，根據(jù)試劑盒說明書操作。每組標本測量重復2次，取平均值，組胺濃度以μg/g組織質(zhì)量計算。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料的比較

共納入腹瀉型腸易激綜合征(D－IBS)患者34例，其中男性12例，女性22例，平均年齡(41±6.5)歲;納入健康對照15例，其中男性6例，女性9例，平均年齡(45±7.2)歲。健康對照包括3例無癥狀查體者，8例結(jié)腸息肉治療后復查者，4例有結(jié)直腸癌家族史，健康對照者均無消化道癥狀。所有納入者結(jié)腸鏡檢查均無陽性發(fā)現(xiàn)。

2.2 結(jié)腸肥大細胞分布及計數(shù)的比較

通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶陽性的肥大細胞主要分布于健康對照和D－IBS患者結(jié)腸黏膜的固有層(圖1，見第668頁)，位于黏膜層腺體之間，在黏膜上皮和腺體內(nèi)分布很少。使用類胰蛋白酶對肥大細胞標記(圖2A，見第668頁)后，用DAPI對細胞核染色(圖2B，見第668頁)發(fā)現(xiàn)類胰蛋白酶位于肥大細胞胞質(zhì)(圖2C，見第668頁)。通過對肥大細胞計數(shù)統(tǒng)計學比較發(fā)現(xiàn)腹瀉型腸易激綜合征患者肥大細胞計數(shù)明顯高于正常對照(P=0.004，見表1)。

表1 D-IBS患者與健康對照肥大細胞計數(shù)及類胰蛋白酶含量的比較Table 1 Comparison of mast cell counts and MCT contents between D-IBS patients and healthy controls

2.3 腹瀉型IBS肥大細胞與癥狀相關(guān)性的比較

所有腹瀉型IBS患者均出現(xiàn)腹痛、腹瀉癥狀，腹痛程度的評分為(1.94±0.89)分，平均病程為(61.2±52.0)月。通過與肥大細胞計數(shù)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)腹瀉型IBS患者腹痛程度與肥大細胞計數(shù)呈正相關(guān)(r=0.35，P=0.04)，而肥大細胞計數(shù)與病程無明顯相關(guān)性(r=0.15，P=0.38，見圖3)。

2.4 腸黏膜類胰蛋白酶水平的比較

本實驗通過ELISA發(fā)現(xiàn)肥大細胞脫顆粒產(chǎn)物組胺在健康對照結(jié)腸黏膜的濃度為(0.045±0.018)μg/g組織，在腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜的濃度為(0.083±0.025)μg/g組織，通過統(tǒng)計學比較本實驗發(fā)現(xiàn)D－IBS組胺水平明顯高于健康對照(P＜0.01，見表1)。

3 討論

腸易激綜合征主要變現(xiàn)為腹痛、大便習慣改變等癥狀，病因和發(fā)病機制尚不清楚，在腸易激綜合征患者腸黏膜很少發(fā)現(xiàn)病理改變。大量的研究證實了肥大細胞在腸易激綜合征特別是腹瀉型患者中增多，提示肥大細胞在腸易激綜合征發(fā)病中發(fā)揮作用。本研究證實D－IBS患者腸黏膜肥大細胞增多與腹痛程度相關(guān)，同時肥大細胞產(chǎn)物類胰蛋白酶含量增高。肥大細胞通常通過參與腸道炎癥和過敏反應(yīng)在腸道疾病中發(fā)揮作用，而肥大細胞活化后會釋放類胰蛋白酶、組胺、白三烯、P物質(zhì)等產(chǎn)物，這些炎癥因子會通過與腸道黏膜受體結(jié)合調(diào)節(jié)內(nèi)臟感知、運動等生理過程。

本實驗通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)肥大細胞在DIBS患者中增高，這與以往的研究結(jié)果一致［3］。說明肥大細胞增多是IBS患者腸道發(fā)生的病理改變之一。但是肥大細胞增加的機制尚不明確，原因之一可能與腸道黏膜免疫反應(yīng)有關(guān)，當腸道存在食物過敏、腸道感染等抗原刺激時，肥大細胞作為抗原感受器參與腸道黏膜的免疫調(diào)節(jié)，這在以往的研究中已經(jīng)證實［6］。另一個可能的機制與心理應(yīng)激有關(guān)，當應(yīng)激發(fā)生時，CRF分泌增加并直接作用腸黏膜肥大細胞促使其釋放活性介質(zhì)［7］，多個動物實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可以引起腸黏膜肥大細胞的增加，提示肥大細胞參與腦腸軸對內(nèi)臟敏感性的調(diào)節(jié)［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞主要位于結(jié)腸黏膜固有層腺體之間，這與腸道神經(jīng)纖維分布一致，已有研究證實肥大細胞與腸黏膜神經(jīng)纖維的距離與腸易激綜合征的發(fā)生有關(guān)［9］。同時腸道神經(jīng)存在肥大細胞產(chǎn)物的受體，當這些受體活化后可以通過多種方式參與內(nèi)臟感知和運動的調(diào)節(jié)，如組胺可以作用于神經(jīng)纖維的H1受體改變腸道的肌電活動［10］，而肥大細胞直接分泌的化學介質(zhì)間接改變腸道神經(jīng)原的痛覺閾值并引起腹痛的發(fā)生［11］。本實驗通過酶聯(lián)免疫吸附實驗發(fā)現(xiàn)肥大細胞產(chǎn)物之一的類胰蛋白酶在結(jié)腸黏膜含量增多，而類胰蛋白酶主要分布于肥大細胞，它可以作用于蛋白激活酶受體PAR-2發(fā)揮作用［12］。而有研究發(fā)現(xiàn)PAR-2表達于腸道神經(jīng)元，其活化后通過信號轉(zhuǎn)導參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟感知，腸黏膜通透性以及腸道動力等生理過程［13］。

本實驗通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜肥大細胞增多與D-IBS患者腹痛的程度有關(guān)，提示肥大細胞可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性參與IBS的發(fā)生，而近期一項臨床研究證實肥大細胞膜穩(wěn)定劑酮替芬可以緩解腸易激患者腹痛等癥狀［14］，而多項動物實驗也證實當肥大細胞活化后大鼠內(nèi)臟敏感性增加［15，16］，這充分說明了肥大細胞脫顆粒產(chǎn)物促進腹痛的發(fā)生。但是本實驗并未發(fā)現(xiàn)肥大細胞計數(shù)與D－IBS患者的病程有相關(guān)性，研究者推測腸易激綜合征患者腸黏膜肥大細胞活化是一過性的反應(yīng)，只有存在感染、心理應(yīng)激時才會出現(xiàn)，當這些誘發(fā)因素消失時，并不出現(xiàn)累積性的效應(yīng)，因此與病程的長短并無關(guān)聯(lián)。

本研究證實了腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜肥大細胞明顯高于健康對照，同時發(fā)現(xiàn)這與腹痛嚴重程度有關(guān)，肥大細胞可能通過活化后其類胰蛋白酶等產(chǎn)物含量增高調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺而參與腸易激綜合征的發(fā)生。因此，肥大細胞穩(wěn)定劑等以腸道肥大細胞作為靶點的藥物為腸易激綜合征患者提供了新的治療選擇。

圖3 肥大細胞計數(shù)的比較及與D－IBS患者癥狀相關(guān)性的比較Figure 3 Comparison of mast cell counts between D-IBSpatients and healthy controls，and its correlation with symptoms in D-IBSpatients

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