王巧文，錢澤秀，孫紅祥

(浙江大學動物科學學院，杭州310058)

合歡皮(Cortex Albizziae)為豆科植物合歡(Albizziajulibrissin Durazz.)的干燥莖皮，其味甘、性平，具安神解郁、活血消腫功，主治心神不安、躁動不安、跌打損傷和愴惶療毒等癥［1］。合歡皮含有三萜皂苷、生物堿、黃酮類、木脂素、多糖等多類化學成分，其中三萜皂苷是合歡皮的主要有效成分，具有廣泛的生理活性和藥理作用，如抗抑郁、抗生育、抗氧化、抗糖尿病、抗菌、保肝、抗血管生成、抗腫瘤、抗菌和免疫調節(jié)等［2-4］。近年來，研究發(fā)現合歡皮總皂苷對禽流感–新城疫重組二聯(lián)活疫苗［5-6］、豬偽狂犬病弱毒疫苗［7］、豬 O 型口蹄疫滅活疫苗［8］等商品疫苗均具有顯著的佐劑作用，并在靶動物上得到了證實。為了建立科學、合理的提取工藝，進一步促進合歡皮總皂苷作為疫苗佐劑新獸藥的研究與開發(fā)，試驗根據合歡皮中皂苷的理化性質，建立了以齊墩果酸為對照品，分光光度法測定含量的方法，并采用單因素試驗和正交設計方法，以總皂苷收率為指標，對醇提工藝乙醇濃度、乙醇用量、提取時間和提取次數進行考察，優(yōu)選合歡皮總皂苷的提取工藝。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備 TU-1800PC型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);Sartorious 1700型電子天平(W-Germany);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司);W501型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);R502B型旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 試劑 合歡皮絲，浙江省景岳堂藥業(yè)有限公司，批號:13073103;齊墩果酸對照品，中國食品藥品檢定研究院 (110709-200304);試驗用水為超純水;所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總皂苷含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品11.0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取10 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得濃度為0.044 mg/mL的齊墩果酸對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶中，按實驗設置的處理條件提取。提取液濾過，合并濾液，減壓回收乙醇、以超純水調整體積至50 mL。取20 mL經等體積乙醚萃取3次脫脂后，以等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑、濃縮至干，加甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，精密吸取0.5 mL于10 mL容量瓶并定容，混勻，即得樣品溶液。

2.1.3 檢測波長選擇 精密吸取對照品溶液2.0 mL和樣品溶液0.5 mL，分別置于10 mL刻度螺紋試管中，70℃恒溫水浴加熱蒸干。精密加入5%香草醛–冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密封，60℃水浴反應15 min，冰浴冷卻10 min，再精密加入5 mL冰醋酸，搖勻。以空白試劑做參比，用TU-1800型紫外可見分光光度計，于400～700 nm波長范圍內掃描。結果齊墩果酸和樣品溶液均在550 nm波長處有最大吸收，故選擇550 nm為測定波長。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 至10 mL 刻度試管中，按“2.1.3”項下方法操作，以空白試劑做參比，按紫外分光光度法于550 nm波長處測定吸光度［1］。以吸光度A為縱坐標、齊墩果酸濃度C(μg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為:A＝0.0418C+0.0022(r＝0.9991)?？梢姡R墩果酸在每mL含3.67～18.33 μg的濃度范圍內，其濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取樣品溶液5份，按“2.1.3”項下方法操作，于550 nm波長處測定吸光度，RSD為0.10%(n＝5)，表明該方法精密度良好。

2.1.6 樣品溶液穩(wěn)定性 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項下方法處理，分別顯色后0、5、10、15、20、25、30 min，于 550 nm 波長處測定吸光度。結果吸光度基本一致，RSD為0.20%(n＝6)，說明樣品溶液顯色后30 min內基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批藥材6份，分別按“樣品溶液制備”項下方法制備樣品溶液，“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算總皂苷含量，RSD為0.92%(n＝6)，說明重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批藥材6份，加入不同量的齊墩果酸標準品，按“樣品溶液制備”項下制備樣品溶液，“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算加樣回收率。結果平均回收率為100.33，RSD為1.50%(n＝6)?？梢?，本方法能準確地測定合歡皮總皂苷含量。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時間2 h、提取次數3次、提取溶劑用量12倍的條件下，分別用質量濃度50%、60%、70%和80%乙醇進行提取。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖1。隨著乙醇濃度的增加，合歡皮總皂苷收率呈先增大后減小。因此，選擇60%、70%、80%作為正交試驗中乙醇濃度的3個水平。

2.2.2 乙醇用量考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時間2 h、提取次數3次、乙醇濃度70%的條件下，分別以藥材量的6、8、10和12倍的乙醇進行提取。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖2。隨著乙醇用量倍數的增加，總皂苷收率呈增加的趨勢。因此，選擇10、12、14倍作為正交試驗中乙醇用量的3個水平。

圖1 乙醇濃度對總皂苷收率的影響

圖2 乙醇用量對總皂苷收率的影響

2.2.3 提取時間考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定提取次數為3次、乙醇濃度70%、乙醇用量12倍的條件下，按每次提取時間分別為1、1.5、2、2.5 h 進行提取。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖3。2 h以內隨著提取時間的增加，總皂苷收率呈增加的趨勢，然而再延長提取時間差異不顯著。因此，選擇1、1.5和2 h作為正交試驗中提取時間的3個水平。

2.2.4 提取次數考察 準確稱取10 g合歡皮絲，置于500 mL圓底燒瓶。恒定回流時間為2 h、乙醇濃度70%、用量12倍的條件下，分別提取1次、2次、3次和4次。按“2.1”項下方法測定總皂苷含量，計算總皂苷收率(mg/g)，結果見圖4，提取2次總皂苷收率顯著高于1次，而2次、3次和4次之間總皂苷收率差異不顯著?？紤]到提取次數增多增加能耗，且2次基本提盡總皂苷。因此，在正交試驗中固定提取次數為2次。

圖3 提取時間對總皂苷收率的影響

圖4 提取次數對總皂苷收率的影響

2.3 正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇影響合歡皮總皂苷收率因素中有統(tǒng)計學意義的水平做正交試驗，采用 L9(34)正交試驗表考察最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表1，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 方差分析表

由表2極差R的數據分析可知:各因素的影響程度依次為B＞C＞A，即乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量。方差分析結果表明:B因素(乙醇濃度)對總皂苷收率有顯著的影響(P＜0.01)，而A(乙醇用量)和C(提取時間)因素無顯著性影響(P＞0.05)，以A3B2C3組合為佳，即乙醇用量14倍、乙醇濃度70%和提取時間2 h。

2.4 驗證試驗 取同一批藥材，按上述確定最佳組合A3B2C3進行驗證試驗，結果見表4。A3B2C3工藝提取的總皂苷平均收率為8.617 mg·g-1，RSD＝0.115%(n＝3)。驗證試驗合歡皮總皂苷收率高于正交試驗中各次的結果，說明該提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表4 驗證試驗結果

3 討論

合歡皮中皂苷化合物種類多，化學結構復雜。目前分離得到的40多個化合物多為齊墩果烷型苷元與8～9個單糖分子以及二分子單萜烯酸(辛二烯酸衍生物)結合而成的一系列分子量在2000左右的三萜皂苷，包括單糖鏈、雙糖鏈和三糖鏈［4］。目前文獻報道的合歡皮總皂苷含量測定方法包括紫外分光光度法［9］和 HPLC法［10］。由于合歡皮中皂苷化合物的化學結構具有極大的相似性，分離純化十分困難，目前尚無法定的合歡皮皂苷標準品。鑒于合歡皮中皂苷多為齊墩果烷型皂苷，上述二種定量方法均選用齊墩果酸為對照品。HPLC法需先通過酸水解將皂苷水解成苷元，然后檢測齊墩果酸［10］。此法操作復雜繁瑣，且合歡皮皂苷有多種苷元。紫外分光光度法所需設備及操作簡單，易普及推廣，靈敏度、準確度、重復性較高，應用范圍廣。因此，本文采用紫外分光光度法，對文獻方法［9］作了改進，并進行了方法學考察。證實該方法操作簡便、準確性高、穩(wěn)定性強、重現性好，可行性良好。

有關合歡皮皂苷制備工藝，施建軍等［10］曾以干粉得率、總苷含量、對人微血管內皮細胞的IC50值為指標，選取乙醇濃度、回流時間、提取次數、萃取次數四種因素，采用正交試驗法優(yōu)化了乙醇回流–水飽和正丁醇萃取工藝路線，得到了最優(yōu)提取路線為用70%的乙醇，提取2次，每次回流3 h，最后用正丁醇萃取4次。該工藝使用的正丁醇沸點高，回收困難，不利于大生產。實驗室前期篩選得到的具有佐劑活性的合歡皮總皂苷采用適于工業(yè)化大生產的乙醇回流–大孔樹脂洗脫工藝路線制備。試驗選擇對合歡皮皂苷提取影響較大的乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數四個關鍵因素進行單因素試驗，確定正交試驗的因素和水平設置。在此基礎上，通過正交試驗法優(yōu)選合歡皮總皂苷的最佳提取工藝條件，即乙醇用量14倍、濃度乙醇70%、提取2次、每次2 h，得到的合歡皮總皂苷收率為 8.617 mg·g-1。

該提取工藝操作簡單、穩(wěn)定、可行，為合歡皮總皂苷后續(xù)的純化、以及合歡皮總皂苷作為疫苗佐劑新獸藥的研究與開發(fā)奠定了基礎。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典 二○一○年版［S］.

［2］侯永坤，番雨利，冷艷華.合歡屬植物中三萜皂苷及藥理活性研究進展［J］.中國醫(yī)藥導報，2010，7(29):7-8.

［3］Kokila K，Priyadharshini S D，Sujatha V.Phytopharmacological properties of Albizia species:a review ［J］.Int J Pharm Pharm Sci，2013(Supp 3)，5:70-73.

［4］Han LF，Pan GX，Wang YF，et al.Rapid profiling and identification of triterpenoid saponins in crude extracts from Albizia julibrissin Durazz.by ultra high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry ［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55:996-1009.

［5］何樹旺.合歡皮皂苷佐劑活性的研究［D］.杭州:浙江大學，2009.

［6］李富強.合歡皮皂苷佐劑的免疫學活性研究［D］.杭州:浙江大學，2010.

［7］施明華.合歡皮皂苷佐劑活性部位對兩種獸用疫苗的佐劑作用［D］.杭州:浙江大學，2012.

［8］張 娟.合歡皮皂苷對豬O型口蹄疫滅活疫苗的佐劑作用［D］.杭州:浙江大學，2014.

［9］馮 磊，陳 爽，邱麗穎，等.紫外分光光度法測定合歡皮總皂苷的含量［J］.華西藥學雜志，2009，24(6):642-644.

［10］施建軍，譚 瑩，杜 斌，等.HPLC法測定合歡皮抗新生血管有效部位中的總皂苷［J］.中成藥，2012，34(10):2025-2028.

［11］施建軍.合歡皮總皂苷提取工藝路線的優(yōu)化和質量標準的初定［D］.無錫:江南大學，2012.