董嘉文，李林林，孫敏華，袁建豐，鄺瑞歡，胡奇林

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東 廣州 510640）

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（MDPV）引起的一種急性傳染病，主要侵害1～3周齡的雛番鴨，故又稱為“三周病”。其發(fā)病率為26%～62%，病死率為22%～43%，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)種危害最嚴重的傳染病之一，嚴重地影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展[1]。目前，番鴨細小病毒病的預防主要以弱毒疫苗為主，但弱毒疫苗存在著毒力返強的缺點，而基因工程疫苗如核酸疫苗具有安全、穩(wěn)定性好、能誘導體液免疫和細胞免疫應答等諸多優(yōu)點，是未來疫苗的發(fā)展方向。

MDPV的基因組為單鏈、線狀DNA，MDPV全長均為5 132 bp。VP3是病毒的主要衣殼蛋白，該基因全長1 605 bp，編碼534個氨基酸，能誘導機體產(chǎn)生抗體，也是MDPV的免疫保護性抗原[2-3]。白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)能誘導T淋巴細胞增殖，刺激細胞分泌IFN-γ等細胞因子，促進機體的細胞免疫反應；同時也能激活B淋巴細胞，參與機體的體液免疫應答[4]。CpG基序可直接活化免疫細胞，誘導Thl型細胞因子的產(chǎn)生，增強針對編碼抗原的特異性免疫應答[5]。

因此，本研究將VP3基因和免疫刺激基序（CpG）克隆至真核表達質粒pIRES-dIL2，構建了番鴨細小病毒核酸疫苗質粒pIRES-dIL2-VP3-CpG，并在BHK-21細胞中獲得表達。本試驗在國內(nèi)首次把CpG基序引入含有表達MDPV VP3基因的核酸疫苗質粒中，為研制新型番鴨細小病毒核酸疫苗奠定基礎，具有重要的理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1 病毒、質粒和單抗 MDPV gd分離株由本實驗室分離鑒定和保存；pMD-dIL2質粒由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院羅滿林教授惠贈；pIRES-dIL2質粒由本實驗室構建和保存；鼠抗MDPV單克隆抗體由本實驗室制備。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I，購自NEB；預混Ex Taq、T4 DNA連接酶、MiniBest病毒RNA/DNA抽提試劑盒、DNA Marker，購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒和小量質粒提取試劑盒，購自天根生物科技（北京）有限公司；質粒中提試劑盒，購自QIAGEN公司；羊抗鼠IgG為Protein Tech Group公司產(chǎn)品。

1.3 MDPV VP3基因的克隆

1.3.1 引物合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的MDPV全基因組設計并合成了1對引物，擴增片段為1 623 bp。90 bp的CpG序列[7-9]含有6個GTCGTT基序、3個TTGCTT基序和2個AGCGCT基序，基序間以TT相連，由上海捷瑞生物工程有限公司合成并克隆至pGHB2317G載體。

MVP3-F：5'-CTAGCTAGCATGGCAGAGGGAG GAA-3'（Nhe I）；

MVP3-R：5'-CCGCTCGAGTTACAGATTCTGA GTCAA-3'（Xho I）；

CPG：5'-CG ACGCGT GTCGTT TT GTCGTT TT GTCGTT TT TTGCTT TC TTGCTT TC TTGCTT TC A GCGCT AGCGCT TC GTCGTT TT GTCGTT TT GTCGTT ACGCGT GC-3'（Mlu I）。

1.3.2 PCR擴增 用病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取病毒DNA。PCR反應體系為：預混Ex Taq 25 μL，引物各2 μL，模板DNA 4 μL，用蒸餾水補至50 μL。PCR反應條件為:95℃預變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸2 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.4 MDPV核酸疫苗重組質粒的構建及鑒定 用Nhe I和Xho I雙酶切重組表達質粒pIRES-dIL2和VP3基因，按照常規(guī)方法構建重組表達質粒pIRES-dIL2-VP3。用MluⅠ酶切pIRES-dIL2-VP3和pGH-CPG，按常規(guī)方法構建重組表達質粒pIRES-dIL2-VP3-CPG。將構建好的質粒送測序進行進一步鑒定。

1.5 MDPV核酸疫苗重組質粒轉染細胞 在24孔培養(yǎng)板中接種傳代BHK-21細胞，當細胞長滿至80%單層，將營養(yǎng)液棄掉，用Hank′s洗滌細胞兩遍。接種轉染試劑，即在50 μL DMEM中加入Lipofectamine TM 2000輕輕混勻，另外取 50 μL DMEM加入純化質粒DNA 1 μg混勻；然后將上述兩種稀釋液混合，室溫孵育20 min，加入細胞板內(nèi)，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用5 h，更換新鮮配制的含2%FCS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收取細胞。

1.6 間接熒光抗體試驗檢測 pIRES-dIL2-VP3-CPG質粒轉染24 h后，棄去細胞生長液，用PBS(pH值7.4)輕輕洗滌細胞3次；將轉染的細胞用乙醇:丙酮（4∶6）混合液室溫固定10 min，自然晾干后將鼠抗MPV單克隆抗體作為一抗（1∶50稀釋），37℃濕盒內(nèi)孵育 l h；PBS洗滌3次，加入FITC 標記的羊抗鼠 IgG（1∶100倍稀釋），37℃1 h后，PBS洗滌3次，在熒光倒置顯微鏡下鏡檢。試驗同時設pIRES空載體轉染細胞作為對照。

2 結果

2.1 MDPV核酸疫苗重組質粒的構建 用Nhe I、Xho I雙酶切pIRES-dIL2和VP3基因，把VP3基因定向克隆至pIRES-dIL2中，構建重組表達質粒pIRES-dIL2-VP3轉化、提取質粒再進行雙酶切鑒定。從圖1可見長約6 460 bp（pIRES-dIL2）和1 605 bp（VP3基因）DAN條帶。重組表達質粒pIRES-dIL2-VP3和pGH-CpG同時經(jīng)過MluⅠ酶切、連接和轉化，構建出重組表達質粒pIRES-dIL2-VP3-CpG。從圖2可見長約90 bp的CpG片段。由此證明，pIRES-dIL2-VP3-CpG重組表達質粒已經(jīng)成功構建。

2.2 間接免疫熒光抗體法檢測質粒在 BHK-21的瞬時表達 pIRES-dIL2-VP3-CpG重組質粒以脂質體法轉染BHK-21細胞，進行間接免疫熒光試驗，從圖中可以看到細胞漿內(nèi)出現(xiàn)了綠色熒光（圖3a），進一步表明了pIRES-dIL2-VP3-CpG質粒成功地在真核細胞內(nèi)表達，而pIRES空載體轉染的細胞沒有檢測到熒光（圖3b）。

3 討論

MDPV基因組含有主要兩個開放閱讀框架(ORF)，左側ORF編碼非結構蛋白(NS)右側ORF編碼3種結構蛋白，VP2和VP3基因編碼的氨基酸位于VP1基因內(nèi)部。VP3是病毒的主要衣殼蛋白，約占總蛋白含量的80%。Le Gall-Recule[1]等利用桿狀病毒系統(tǒng)表達MDPV衣殼蛋白(VP2-VP3)，Western blotting證實重組的衣殼蛋白可以與MPV抗血清反應。李雪梅等[9]將鵝細小病毒(GPV)番鴨細小病毒(MPV)主要結構蛋白(VP2-VP3)基因克隆到核酸疫苗質粒pIRES1neo載體上構建了核酸疫苗，轉染鴨胚成纖維細胞后，并對其表達產(chǎn)物進行Western blotting檢測。國內(nèi)外學者利用真核表達系統(tǒng)表達了禽IL-2蛋白，探討了禽IL-2真核表達質粒和重組蛋白作為疫苗佐劑應用的潛力[10-11]。近年來，CpG免疫佐劑已經(jīng)用于家禽和水禽的DNA疫苗研究中，石星明等[8]將CpG基序克隆至真核表達載體可作為新城疫病毒DNA疫苗的高效免疫增強劑，提高抗原特異性免疫應答，誘導高水平保護性抗體。

本研究將VP3基因和CpG基序克隆至質粒pIRES-dIL2中，構建了核酸疫苗質粒pIRES-dIL2-VP3-CpG，通過脂質體法轉染BHK-21細胞，間接免疫熒光試驗證明，轉染質?？稍诩毎麧{中檢測到綠色熒光，表明本試驗構建的核酸疫苗質粒能在真核細胞內(nèi)表達。引入CpG基序的MDPV核酸疫苗質粒的成功構建和表達為探索CpG作為MDPV核酸疫苗免疫增強劑的可能性以及為研制新型番鴨細小病毒核酸疫苗奠定了基礎。

[1]Le Gall-Recule G，Jestin V，Chagnaud P，et al.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins(VP2and VP3)in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins.Journal of General Virology[J].1996，77，2159-2163.

[2]程由銓，胡奇林，陳少鶯，等.番鴨細小病毒和鵝細小病毒生化及基因組特性的比較[J].中國獸醫(yī)學報，2001，21(5)：429-433.

[3]Le Gall-Recule G，Jestin V.Biochemical and genomic characterization of muscovy duck parvovirus.Archives of Virology[J].1994，139（1-2）:121-131.

[4]Swain S L.Lymphokines and the immune response:the central role of interleukin-2[J].Curr Opin Immunol，1991，3（3）:304-310.

[5]Krieg A M，Hartmann G，Yi A K.Mechanism of action of CpG DNA[J].Curr top Microbiol Immunol，2000，247:1-21.

[6]朱鴻飛，朱建中，李光富，等.體外篩選對雞具有免疫刺激活性的CpG寡脫氧核苷酸[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27(2)：83-86.

[7]李杰，楊漢春，郭鑫，等.CpG ODN對雞新城疫LaSota活疫苗的免疫增強效應[J].畜牧獸醫(yī)學報，2006，37（1）：44-49.

[8]石星明，王玫，張晶，等.CpG基序對新城疫病毒DNA免疫效果的影響[J].中國預防獸醫(yī)學報，2010，32（7）：554-558.

[9]李雪梅，章金剛，向華，等.鵝細小病毒和番鴨細小病毒核酸疫苗重組質粒的構建及表達[J].生物技術通訊，2002，13（6）：433-435.

[10]Sreekumar E，Premraj A，Rasool T J.Duck(Anas platyrhynchos),Japanese quail(Coturnix coturnix japonica)and other avian interleukin-2 reveals significant conservation of gene organization,promoter elements and functional residues[J].Int J Immunogenet，2005，32（6）:355-365

[11]Jai-Wei Lee，Yu-Ming Lin，Ting-Ying Yen，et al.CpG oligodeoxynucleotides containing GACGTT motifs enhance the immune responses elicited by a goose parvovirus vaccine in ducks[J].Vaccine，2010（28）：7956-7962.