李 翠，郭彩云，戴志紅，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

雞傳染性法氏囊病(Infectious of bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious of bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度傳染性疾?。?］。在我國對該病的主要防治措施是對雞群進行疫苗免疫，而疫苗質(zhì)量的好壞直接關(guān)乎免疫預防的成敗。雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)作為國內(nèi)最常使用的雞傳染性法氏囊病疫苗，目前主要采用雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定法測定該疫苗的病毒含量以確定其效力［2］。由于SPF雞胚價格高，且病毒含量測定所需的周期較長，使得檢驗成本增加，因此建立一種更加經(jīng)濟、快速測定該疫苗病毒含量的方法具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，雞傳染性法氏囊病毒在原代雞胚成纖維細胞(CEF)、Vero細胞等都有很好的適應性［3］，但不產(chǎn)生明顯的細胞病變，可以通過熒光染料染色后呈現(xiàn)強烈的熒光。試驗采用Vero細胞建立細胞免疫熒光方法，確定了高免血清及二抗適宜稀釋濃度、接度量和方法的特異性，并與傳統(tǒng)雞胚半數(shù)致死量(ELD50)方法進行了敏感性和相關(guān)性比較，細胞免疫熒光方法具有更高的敏感性，且兩種方法具有良好的相關(guān)性。本研究為今后該疫苗的病毒含量測定提供了一個新途徑。

1 材料

1.1 疫苗和細胞 雞傳染性法氏囊病毒為本研究室制備的雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)參考品(批號:S0531111);Vero細胞由華中農(nóng)業(yè)大學實驗室贈予;SPF雞胚，梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、犢牛血清、0.25%胰酶，Gibco公司;0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS);丙酮、甲醇，北京化學試劑公司;雞傳染性法氏囊病陰、陽性血清(批號:2010)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心;羊抗雞IgG(產(chǎn)品編號:bs-0310GAF488)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 病毒接種 將Vero細胞接種48孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至單層，棄去培養(yǎng)液，接種雞傳染性法氏囊病毒液，培養(yǎng)48 h。

2.2 間接免疫熒光(IFA)試驗 參照文獻［4］進行。一抗為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的雞傳染性法氏囊病毒高免血清，二抗為羊抗雞IgG，同時設(shè)陰性血清、生理鹽水和不接毒加陽性高免血清三組對照。

2.3 高免血清及二抗適宜稀釋濃度的確定 用0.01mol/L pH7.4的PBS緩沖液對羊抗雞IgG熒光抗體作1∶100、1∶200、1∶300、1∶400 系列稀釋，每孔100 μL，分別與用生理鹽水作1∶100稀釋的雞傳染性法氏囊病高免血清反應，以確定熒光抗體適宜濃度;用生理鹽水將雞傳染性法氏囊病高免血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 系列稀釋，每孔100 μL，分別與適宜濃度的熒光抗體進行反應，以確定雞傳染性法氏囊病高免血清的適宜稀釋度。

2.4 接毒量的確定 分別將每0.2 mL病毒含量ELD50值為104.5的疫苗液10倍系列稀釋得每0.2 mL 病毒含量 ELD50值為 103.5、102.5、101.5、100.5的稀釋液，每孔分別接種0.2、0.1和0.05 mL，各接種三塊48孔板，48 h后固定染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.5 特異性試驗 長成單層的Vero細胞，分別接種雞傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒、禽白血病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒，同時設(shè)接種雞傳染性法氏囊病毒和正常細胞對照，固定染色，在熒光顯微鏡下觀察。

2.6 敏感性試驗 隨機抽取5支半數(shù)致死量對數(shù)值(lgELD50)定值為4.19±0.15的雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)，分別稀釋至每0.2 mL病毒含量 ELD50值為 103.5、102.5、101.5、100.5，在單層Vero細胞板上每孔分別接種各稀釋度的疫苗液200 μL，各5孔，培養(yǎng) 48 h后，固定染色，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。按Reed法計算TCID50值，并按平均值±標準偏差定值樣品的lgTCID50值，以比較兩種方法的敏感性。

2.7 ELD50和TCID50方法測定疫苗病毒含量的比較 隨機抽取10支雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度分別定量接種單層Vero細胞和SPF雞胚，每個稀釋度接種5個重復。接毒細胞培養(yǎng)48 h，固定染色，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，“++”及以上結(jié)果判為陽性，計算各稀釋度出現(xiàn)特異性熒光的百分率。接毒雞胚培養(yǎng)7 d，觀察結(jié)果。按Reed法分別計算ELD50值和 TCID50值。并采用 SAS軟件對 ELD50值和TCID50值進行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 細胞間接免疫熒光方法的建立試驗結(jié)果 接種0.05 mL病毒含量為102.5ELD50/0.2 mL的細胞孔中無陽性熒光，0.2mL組和0.1 mL組對應各細胞孔熒光無明顯差別，因此接毒量選擇每孔接種0.1 mL(圖1)。

3.2 高免血清及二抗適宜稀釋濃度的確定 將高免血清與各稀釋度二抗進行棋盤式組合試驗，結(jié)果表明，1∶200稀釋度的高免血清與1∶300稀釋度的二抗組合時，觀察到的熒光最清晰，而降低或增加高免血清和二抗?jié)舛葧r，觀察到的熒光均不很清晰(圖2)。

3.3 特異性試驗 雞傳染性法氏囊病毒檢測結(jié)果為陽性，雞傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒、禽白血病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒和正常細胞對照未見熒光，均為陰性。

3.4 敏感性試驗 細胞間接免疫熒光方法敏感試驗結(jié)果見表1，數(shù)據(jù)結(jié)果匯總見表2。

按Reed法計算5支樣品的TCID50值，其對數(shù)值(lgTCID50)值分別為:5.67、5.60、5.75、5.37、5.56。按平均值±標準偏差定值樣品的lgTCID50值結(jié)果為:5.59±0.14。與半數(shù)致死量的對數(shù)值(lgELD50)的定值結(jié)果4.19±0.15比較可見，該方法穩(wěn)定，具有更高的敏感性。

圖1 接毒量實驗結(jié)果

圖2 高免血清及二抗適宜稀釋濃度的確定

表1 細胞間接免疫熒光敏感性試驗結(jié)果

表2 細胞間接免疫熒光敏感性試驗結(jié)果統(tǒng)計

表3 lgELD50與lgTCID50對數(shù)值的對比結(jié)果

3.5 ELD50值與TCID50值相關(guān)性的對比 隨機抽取的10支雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)，以傳統(tǒng)的ELD50方法與TCID50方法同時測定病毒含量。試驗結(jié)果見表3。

傳統(tǒng)ELD50方法測定值為A組數(shù)據(jù)，間接免疫熒光TCID50方法測得值為B組數(shù)據(jù)，A組平均數(shù)(Mean)＝3.74，B組平均數(shù)(Mean)＝5.54，說明TCID50方法具有更高的檢驗靈敏度。采用SAS軟件對兩組數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析［5］，相關(guān)系數(shù)r＝0.83944，當0.7≤︳r︳≤1為高度相關(guān)，因此，傳統(tǒng)ELD50方法和間接免疫熒光TCID50方法測定疫苗病毒含量值具有高度的相關(guān)性。

4 討論

研究建立了細胞間接免疫熒光測定雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量的方法，將毒液進行10倍系列稀釋，感染單層Vero細胞，加高免血清、羊抗雞IgG熒光抗體，根據(jù)細胞板中熒光斑來判定陰陽性，并計算半數(shù)細胞感染量(TCID50)。細胞免疫熒光試驗中，高免血清與熒光抗體的濃度確定，對實驗結(jié)果的判定至關(guān)重要。二者的濃度過高會使背景熒光過重，而導致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，二者濃度過低，則會使視野內(nèi)熒光斑數(shù)量減少，而導致假陰性結(jié)果出現(xiàn)。本研究確定了該方法中高免血清與熒光抗體的適宜濃度，保證實驗出現(xiàn)低背景、高熒光斑的結(jié)果，利于觀察，從而使實驗結(jié)果客觀準確。

研究提供了測定雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量的新方法，確定了特異性，與傳統(tǒng)ELD50測定方法進行了敏感性和相關(guān)性比較，間接免疫熒光方法定值lgTCID50結(jié)果為5.59±0.14，傳統(tǒng)雞胚半數(shù)致死量方法定值的lgELD50結(jié)果為4.19±0.15，可見間接免疫熒光方法具有更高的敏感性。兩種方法的相關(guān)性系數(shù)r為0.83944，表明間接免疫熒光TCID50方法與傳統(tǒng)ELD50方法測定疫苗病毒含量值具有高度的相關(guān)性。而且，該方法避免使用雞胚，降低了檢驗成本，縮短了檢驗周期。本研究為該疫苗的檢驗提供了一個新途徑。陶素華［6］等報道不同毒株的雞傳染性法氏囊病毒可適應于Vero細胞，今后可增加相關(guān)研究將該方法推廣到其他雞傳染性法氏囊病毒疫苗的病毒含量測定。

［1］鄭建浩.淺談雞傳染性法氏囊病的診斷與防治［J］.畜禽業(yè).2008(4):82-83.

［2］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版［S］.

［3］于維軍.國外傳染性法氏囊病病毒學及免疫學的研究進展［J］.中國畜禽傳染病.1990，54(5):55-58.

［4］中國醫(yī)學科學院流行病防治研究所.常見病病毒實驗技術(shù)［M］.北京:科學出版社，1978:55.

［5］楊金秀.統(tǒng)計學原理［M］.長沙:中南大學出版社，2007:263.

［6］陶素華，韋 莉，孫延濤，等.雞傳染性法氏囊病病毒適應于Vero細胞的初步研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，1995，21(12):3-5.