畢研青+郝敏+田萌子+劉效方+孫文凱+王琳琳

【摘要】 目的：觀察PAK4在乳腺結(jié)構(gòu)紊亂組織中的表達(dá)，并探討其與臨床影像學(xué)在乳腺癌早期診斷中的相關(guān)性。方法：對(duì)2012年1月-2013年10月在東營(yíng)市人民醫(yī)院乳腺科住院手術(shù)的150例女性乳腺疾病患者進(jìn)行了回顧性分析。本院病理科取得患者乳腺標(biāo)本蠟塊，部分患者爭(zhēng)取患者同意后行穿刺取乳腺樣本。采用HE染色和PAK4免疫組化染色，制作切片在光鏡下觀察。結(jié)果：非增生性病變與乳腺增生伴不典型增生和乳腺癌組進(jìn)行兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。乳腺增生伴不典型增生與乳腺癌比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。乳腺癌組中PAK4染色的表達(dá)與臨床影像學(xué)鉬靶與超聲診斷呈正相關(guān)性。結(jié)論：提示PAK4與乳腺癌演進(jìn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對(duì)結(jié)構(gòu)紊亂的乳腺疾病有指導(dǎo)手術(shù)治療的意義。

【關(guān)鍵詞】 乳腺結(jié)構(gòu)紊亂； 乳腺癌； 手術(shù)指征； 影像學(xué)； 分子生物學(xué)； PAK4

The Role of PAK4 in the Indications of Breastsurgical Treatment and the Correlation between Its and Molybdenum Target X-ray/BI Yan-qing，HAO Min，TIAN Meng-zi，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：004-007

【Abstract】 0bjective：To investigatethe role of PAK4 in the indications of breast surgical treatment of structural disorder mammary gland and to explore its correlation with clinical imaging in the diagnosis of early breast cancer.Method：150 patients with mammary gland disease who have had surgery treatment were collected from January 2012 to December 2013.The paraffin-embeded samples were obtained from our hospital.HE staining was used to investigate the structure of Mammary gland. PAK4 immunohistochemical staining was used to investigate the expression of different types of breast disease under light microscope.Result：There were obvious difference between the hyperplasia of mammary glands with atypical hyperplasia and the breast cancer about PAK4 immunohistochemical staining.And compared with non proliferative breast disease，the differences were significantly. PAK4 expression in breast cancer group was positively correlation with mammography and ultrasound diagnosis. Conclusion：The PAK4 is closely related to the evolution and transfer of breast cancer and has great significance in the breast surgical treatment in structural disorder of mammary gland disease.

【Key words】 Structural disorder mammary gland； Breast carcinoma； Indications of surgical treatment； Iconography； Molecular biology； PAK4

First-authors address：The Peoples Hospital of Dongying，Dongying 257091，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.002

乳腺結(jié)構(gòu)紊亂是乳腺疾病常見的影像學(xué)改變，也是乳腺癌演變過程中的一個(gè)階段，而乳腺癌是危害婦女健康的主要腫瘤。全世界每年約有120萬(wàn)～140萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌，約有50萬(wàn)婦女死于該病。雖然乳腺癌的治療獲得了較快的發(fā)展，但我國(guó)目前乳腺癌的治療效果仍較差，相比于美國(guó)婦女乳腺癌確診時(shí)80%以上為早期乳腺癌，我國(guó)婦女乳腺癌確診時(shí)70%～80%患者已是中晚期，此時(shí)手術(shù)創(chuàng)傷較大且需要術(shù)后行化學(xué)治療，治療費(fèi)用較高，對(duì)患者的心理及生理影響較大?；颊咝g(shù)后的生存期短，生存質(zhì)量較差。因此，提高我國(guó)乳腺癌遠(yuǎn)期治愈率的關(guān)鍵，取決于對(duì)乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。隨著影像學(xué)的發(fā)展，更多的檢測(cè)手段應(yīng)用于乳腺病的檢查，更多的良性病變被檢測(cè)到，對(duì)評(píng)估某些特殊的乳腺影像學(xué)結(jié)構(gòu)所致乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)性提高了準(zhǔn)確性，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展大家逐漸認(rèn)識(shí)到，真核細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中，通路蛋白的磷酸化和去磷酸化化學(xué)修飾之間的平衡在細(xì)胞正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用，是信號(hào)通路調(diào)控的重要方式。對(duì)細(xì)胞增殖控制不當(dāng)，未能區(qū)分并保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞形狀和極性可發(fā)生癌性轉(zhuǎn)化，這些與控制細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡的細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的失調(diào)密切相關(guān)。P21活化蛋白激酶（P21 activated protein kinases，Paks）在此途徑中扮演著關(guān)鍵的角色。用免疫組化方法檢測(cè)P21蛋白表達(dá)水平的變化，對(duì)于判斷乳腺增生到惡變?cè)谶@一過程中的危險(xiǎn)因素及早診斷乳腺癌、為臨床指導(dǎo)手術(shù)指征等具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。國(guó)內(nèi)已有通過對(duì)P21蛋白在乳腺正常組織及乳腺腺病與乳腺不典型增生組之間，乳腺不典型增生組與增生惡變組之間的檢測(cè)，對(duì)比統(tǒng)計(jì)差異相關(guān)方面的的研究[1]。

1 材料與方法

1.1 材料 選取本院2012年1月-2013年10月在東營(yíng)市人民醫(yī)院乳腺科住院手術(shù)的150例女性乳腺疾病患者。全部患者術(shù)前均行B超、鉬靶檢查，提示乳腺結(jié)構(gòu)紊亂，其中，非增生性病變50例，乳腺增生伴不典型增生病[平坦型上皮非典型性增生（FEA）導(dǎo)管上皮內(nèi)腫瘤1A（DIN 1A）、非典型性導(dǎo)管增生（ADH）導(dǎo)管上皮內(nèi)腫瘤1B （DIN 1B）]50例、乳腺癌50例，其中非增生病變?yōu)锳組（年齡18～55歲），乳腺增生伴不典型增生病變?yōu)锽組（年齡18～56歲），乳腺癌為C組（年齡29～75歲）。本院病理科取得患者乳腺標(biāo)本蠟塊，部分患者爭(zhēng)取患者同意后行穿刺取乳腺樣本。

1.2 研究方法 將收集的蠟塊切片，每個(gè)標(biāo)本切片2份，分別進(jìn)行HE染色、PAK4免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色：（1）脫蠟入水（PBS洗2～3次，每次5 min）。（2）3%H2O2室溫孵育30 min（封閉內(nèi)源性過氧化物酶）。（3）蒸餾水洗3次，5 min/次，浸入PBS 5 min。（4）抗原修復(fù)。（5）PBS洗3次，每次5 min。（6）滴加血清封閉液，放置于室溫下20 min。（7）傾去血清，不洗，滴加一抗，室溫37 ℃孵育l～2 h。（8）PBS洗3次，5 min/次。（9）滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗），37 ℃孵育10～30 min。（10）PBS洗3次，5 min/次。（11）滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min。（12）PBS洗3次，5 min/次。（13）DAB-H2O2顯色5～10 min，隨時(shí)鏡檢（DAB用時(shí)新配）。（14）自來(lái)水沖洗10 min。（15）蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，氨水處理。（16）自來(lái)水沖洗10～15 min。（17）脫水、透明、封片。光鏡下（100倍）對(duì)乳腺標(biāo)本進(jìn)行結(jié)構(gòu)及免疫組化染色觀察。免疫組化染色PAK4染色液及Her2染液由abcam生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) PAK4主要在乳腺腺體細(xì)胞的胞漿和/或胞核表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色或深棕色，采用一抗來(lái)源的同科，動(dòng)物兔的正常IgG作為陰性對(duì)照，以此判斷PAK4免疫染色的特異性；與陰性細(xì)胞對(duì)比鮮明。結(jié)果判斷參照Campo等的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合具體染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色百分率進(jìn)行評(píng)分：著色弱為1分，著色中度為2分，著色強(qiáng)為3分，基本不著色為0分；著色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分，26%～50%為2分，等于或大于51%為3分，5%以下為0分。最后以陽(yáng)性細(xì)胞的百分比以及染色強(qiáng)度記分之和所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定[10-11]。0分為陰性；1、2分為弱陽(yáng)性（+）；3、4分為中等陽(yáng)性（++）；5分或5分以上為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）?？贵w陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：PAK4以3、4分（中等陽(yáng)性，強(qiáng)陽(yáng)性）以上為陽(yáng)性，其余0分、1、2分（陰性，弱陽(yáng)性）為陰性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果由兩位病理學(xué)家在相同的判定標(biāo)準(zhǔn)下雙盲判定，相同判定結(jié)果直接納入統(tǒng)計(jì)，有差異的結(jié)果經(jīng)另一位病理學(xué)家雙盲判定后取三人判定的平均值納入統(tǒng)計(jì)。鉬靶X線陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：鉬靶提示簇狀、泥沙樣鈣化或者毛刺樣、邊緣模糊的結(jié)節(jié)影，BI-RADS分級(jí)Ⅳ～Ⅴ級(jí)判斷為陽(yáng)性結(jié)果。彩超陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫塊形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，呈毛刺狀或蟹足狀，內(nèi)部回聲不均勻，腫塊內(nèi)見微小鈣化灶，腫塊后方回聲衰減、腫塊縱橫比>1，腫塊內(nèi)血流信號(hào)Ⅱ～Ⅲ級(jí)，阻力指數(shù)（RI）>0.7，提示占位性病變者判斷為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用等級(jí)資料多個(gè)獨(dú)立樣本和兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAK4在三組乳腺疾病中的表達(dá)情況 PAK4在非增生性病變（A組）、乳腺增生伴不典型增生（B組）及乳腺癌（C組）中的陽(yáng)性率分別為6%、40%、78%，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 PAK4在三組乳腺疾病中的表達(dá)情況

注：A組與B組比較，P<0.05，A組與C組比較，P<0.05，B組與C組比較，P<0.05

2.2 影像學(xué)特征及PAK4在50例乳腺癌中的表達(dá)情況 50例乳腺癌中PAK4、鉬靶、超聲陽(yáng)性表達(dá)分別為39例（78%）、39例（78%）、41例（82%）。PAK4表達(dá)與鉬靶及彩超陽(yáng)性結(jié)果呈正相關(guān)性（P>0.05）。見表2，圖1～4。

3 討論

據(jù)流行病學(xué)研究統(tǒng)計(jì)，乳腺不典型增生發(fā)展成為乳腺癌的危險(xiǎn)性顯著增加。乳腺增生是最常見的乳腺疾病，又叫乳腺囊性增生癥。包括乳腺疼痛、乳腺小葉增生癥、纖維腺病、纖維化增生癥、乳腺癌（因?yàn)楹芏嗳橄侔┦怯扇橄僭錾鹤儺a(chǎn)生的）。臨床上約有50%婦女有乳腺增生的表現(xiàn)，一般多見于20～50歲的婦女[2]，特別是30歲以上未婚、未育、哺乳少、愛生氣的婦女。乳腺增生癥與乳腺癌的關(guān)系是患者最為關(guān)心的問題，也是眾多學(xué)者爭(zhēng)論與研究的焦點(diǎn)。早期及近來(lái)眾多的研究表明，相對(duì)于非增生性乳腺良性疾病而言，乳腺增生不伴非典型增生者有一個(gè)小幅增加的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而乳腺增生伴非典型增生的患者隨后發(fā)生乳腺癌的發(fā)病率明顯升高[3-5]。目前普遍采用“非增生性”與“增生性”病變來(lái)區(qū)分不同的危險(xiǎn)性。非增生性病變，并不增加乳腺癌的發(fā)病率，而增生性病變發(fā)生乳腺癌的相對(duì)危險(xiǎn)性就升高了，以伴有小葉或?qū)Ч懿坏湫驮錾哂壬酢?/p>

表2 影像學(xué)特征及PAK4在50例乳腺癌中的表達(dá)情況 例（%）

圖1 乳腺增生病，小葉腺體增生，外圍肌上皮細(xì)胞陽(yáng)性，內(nèi)側(cè)腺上皮細(xì)胞陰性（PAK4染色x100）

圖2 乳腺纖維腺瘤，纖維組織增生，擠壓腺體呈裂隙狀，腺體外圍肌上皮細(xì)胞陽(yáng)性，內(nèi)側(cè)腺上皮細(xì)胞陰性（PAK4染色X100）

圖3 原位癌，瘤細(xì)胞散在陽(yáng)性，但導(dǎo)管外圍細(xì)胞均陽(yáng)性（PAK4染色X100）

圖4 乳腺浸潤(rùn)性癌，癌細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)陽(yáng)性（PAK4染色×200）

眾所周知，影像學(xué)的檢查方法為目前早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷乳腺癌的主要途徑。乳腺X線鉬靶攝影的操作原理是將乳房的三維結(jié)構(gòu)投影為二維圖像平面，這種技術(shù)以其較好的病變突出性能、低價(jià)格、以及其簡(jiǎn)單實(shí)用性使人們將它作為無(wú)癥狀女性對(duì)乳腺癌篩查的首選[6]。乳腺癌亦可呈片狀、不規(guī)則高密度影，但病變區(qū)及其周圍乳腺結(jié)構(gòu)紊亂，纖維小梁增粗，可有簇狀鈣化灶，鈣化量多，每平方鈣化數(shù)目在10個(gè)以上，局部皮膚增厚、內(nèi)陷[7]。超聲檢查無(wú)射線損傷，尤其適合妊娠、哺乳期婦女檢查及乳腺疾病的普查和隨訪。其與X線檢查相結(jié)合被稱為目前檢查乳腺癌的“黃金組合”。P21活化蛋白激酶（ P21 activated protein kinases， Paks）家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，最早是作為Rho GTP酶Cdc42和Racl的特異性結(jié)合物而被發(fā)現(xiàn)的[8]，PAK4在第二組PAK中最先被作為Rho GTP酶Cdc42的效應(yīng)蛋白引起細(xì)胞骨架的的改變而被報(bào)道者[9]，隨后被發(fā)現(xiàn)PAK4可被Rho GTP酶單獨(dú)激活[10]，且其在細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)化[11-13]、延長(zhǎng)正常細(xì)胞壽命及促細(xì)胞的凋亡[14]、參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15-17]和正向調(diào)節(jié)一些正常生理代謝等方面都起重要作用。PAK4能在多種癌細(xì)胞與腫瘤中呈高表達(dá)[18-20]，一些研究表明Pak4高轉(zhuǎn)化于纖維母細(xì)胞，同時(shí)也在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用。目前，被廣泛研究的上皮細(xì)胞癌癥轉(zhuǎn)化的典型就是乳腺癌，大量的研究顯示該蛋白家族中的PAK4在乳腺癌組織中高表達(dá)，且遠(yuǎn)高于在其他腫瘤中，且PAK4表達(dá)與乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[21-23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺非增生性病變、乳腺增生伴不典型增生、乳腺癌中的PAK4表達(dá)總體陽(yáng)性率依次升高，采用等級(jí)資料多個(gè)獨(dú)立樣本和兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳腺增生伴不典型增生與乳腺癌中PAK4表達(dá)（圖1～4）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，前兩者分別與乳腺非增生性病變相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者對(duì)50例乳腺癌患者術(shù)前的彩超及鉬靶診斷與PAK4染色情況進(jìn)行了相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，PAK4染色與鉬靶及彩超在早期診斷乳腺癌中呈正相關(guān)性。說(shuō)明PAK4染色對(duì)于判斷乳腺增生性疾病到惡變?cè)谶@一過程中的危險(xiǎn)因素及早診斷乳腺癌、為臨床指導(dǎo)手術(shù)指征等具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。筆者將進(jìn)一步對(duì)乳腺良性疾病向乳腺癌發(fā)展過程中PAK4的變化進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期將乳腺增生性疾病到惡變PAK4的測(cè)量做為手術(shù)指征的一重要指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]劉運(yùn)江，梁志兵，王小玲.Skp2蛋白和P21蛋白在乳腺增生惡變過程中的表達(dá)及意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2008， 11（37）： 91-94.

[2] Goehring C， Morabia A. Epidemiology of benign breastdisease， with special attention to histologic types[J]. Epidemiol Rev， 1997， 19（23）：310-327.

[3] DupontW D， Page D L. Risk factors for breast cancer in women with proliferative breast disease[J]. N Engl J Med， 1985，312（241）： 146-151.

[4] Page D L， Dupont W D， Rogers L W， et al. Atypical hyperplastic lesions of the female breast： a long-term follow-upstudy[J]. Cancer，1985，55（45）：2698-2708.

[5] Geoffrey CKabat，Joan GJones， Neal Olson， et al.A multi-center prospective cohort study of benign breast diseaseand risk of subsequent breast cancer[J].Cancer Causes Control，2010，21（23）：821-828.

[6] Pisano E D，Gatsonis C，Hendrick E，et al.Diagnostic performance of digital versus film mammography for breast-cancer screening[J].New Engl J Med，2005，353（123）：1773-1883.

[7] 汪東方，曹然，朱彬.乳腺常見疾病的鉬靶X線診斷[J]. 影像診斷與介入放射學(xué)，2004， 13（3）：158.

[8] Manser E， Leung T， Salihuddin H， et al. A brain ser ine/threo nine protein kinase activated by Cdc42 and Rac1[J].Nature， 1994， 367（423）：40-46.

[9] Abo A， Qu J， Cammarano M S，et al.PAK4， a novel effector for Cdc42Hs， is implicated in the reorganization of the actin cytoskeleton and in the formation of filopodia[J]. EMBO J，1998，17，（12）：6527-6540.

[10] Paliouras G N， Naujokas M A， Park M.Pak4， a novel Gab1 binding partner， modulates cell migration and invasion by the Met receptor[J]. Mol Cell Biol，2009，29（12）： 3018-3032.

[11] Nekrasova T， Minden A. PAK4 is required forregulation of the cell-cycle regulatory protein p21， andfor control of cell-cycle progression[J]. J Cell Biochem，2011，112（7）：1795-1806.

[12] Callow M G， Clairvoyant F， Zhu S， et al. Requirement for PAK4 in the anchorage-independent growth of human cancer cell lines [J]. J Biol Chem， 2002， 277（1）：550-558.

[13] Liu Y， Chen N， Cui X， et al . The protein kinase Pak4disrupts mammary acinar architecture and promotesmammary tumorigenesis[J]. Oncogene ， 2010，29（44）：5883-5894.

[14] Eswaran J， Soundararajan M， Kumar R， et al .UnPAKing the class differences among p21-activatedkinases[J]. Trends Biochem Sci ， 2008，33（8）：394-403.

[15] Wells C M， Jones G E. The emerging importance of group Ⅱ PAKs [J]. Biochem J ， 2010， 425（3）：465-473.

[16] Siu M K， Chan H Y， Kong D S， et al . p21-Activatedkinase 4 regulates ovarian cancer cell proliferation，migration， and invasion and contributes to poorprognosis in patients[J]. Proc Natl Acad Sci U S A ， 2010，107（43）：18 622-18 627.

[17] Li Z， Lock J G， Olofsson H， et al . Integrin-mediatedcell attachment induces a PAK4-dependent feedbackloop regulating cell adhesion through modified integrinalpha v beta 5 clustering and turnover[J]. Mol Biol Cell，2010， 21（19）：3317-3329.

[18] Callow M G， Clairvoyant F， Zhu S，et al. Requirement for PAK4 in the anchorage-independentgrowth of human cancer cell lines[J]. J Biol Chem， 2002， 277（12）： 550-558.

[19] Chen S， Auletta T， Dovirak O，et al. Copy number alterations in pancreatic cancer identifyrecurrent PAK4 amplification[J]. Cancer Biol Ther， 2008，7（15）：1793-1802.

[20] Kimmelman A C， Hezel A F， Aguirre A J，et al. Genomic alterations link Rho family of GTPases to thehighly invasivephenotype of pancreas cancer[J]. Proc Natl Acad SciUSA， 2008，105（45）：19 372-19 377.

[21] Liu Y， Xiao H， Tian Y，et al. ThePak4 protein kinase plays a key role in cell survival andtumorigenesis in athymic mice[J]. Mol Cancer Res， 2008，6（12）：1215-1224.

[22] Kumar R， Vadlamudi R K. Emerging functions of P21-activated kinases in human cancer cells [J]. J Cell Physiol， 2002， 193 （2）： 133-144.

[23] Grigorios N P， Monica A N， Morag P. Pak4， a novel gab1 binding partner， modulates cell migration and invasion by the Met receptor？[J]. Mol Cell Biol， 2009， 29（11）： 3018-3032.

（收稿日期：2014-07-15） （本文編輯：陳丹云）