王少麗，張友軍，吳青君，謝 文，徐寶云

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

葉螨屬于蛛形綱蜱螨亞綱真螨目葉螨科，俗稱紅蜘蛛，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害螨，為害寄主繁多，包括蔬菜、果樹和棉花Gossypium spp.、小麥Triticum aestivum Linn.等重要農(nóng)作物，其中在蔬菜寄主中，主要喜食茄子Solanum melongena、菜豆Phaseolus vulgaris、黃瓜Cucumis sativus Linn、番茄Lycopersicon esculentum Mill.、莧菜Amaranthus mangostanus L.、水芹Oenanthe javanica (Blume)和蓮藕Nelumbo nucifera G.等作物。葉螨以成螨和幼若螨聚集在植物葉片背面進行刺吸為害，造成葉片上出現(xiàn)失綠斑點，嚴重時葉片干枯脫落，甚至整株死亡，極大地影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

蔬菜葉螨種類很多，根據(jù)以往報道，主要包括截形葉螨Tetranychus truncatus Ehara、朱砂葉螨T.cinnabarinus (Boisduval)、二斑葉螨T.urticae Koch (趙玉偉等，2006;張美淑等，2009;王少麗等，2010)、神澤葉螨T.kanzawai Kishida、土耳其斯坦葉螨T.turkestani (Ugarov et Nikolski)和敦煌葉螨T.dunhuangensis Wang 等。其中截形葉螨、朱砂葉螨和二斑葉螨分布廣泛，它們有時單獨發(fā)生，有時混合發(fā)生。神澤葉螨也可在茄子、辣椒等蔬菜上為害，但報道較少;而土耳其斯坦葉螨和敦煌葉螨則地域性強，分別在新疆和甘肅等地發(fā)生(牙森·沙力等，2007)。由于葉螨體型微小，部分種類非常相似，肉眼識別困難，長期以來很多研究者認為蔬菜上發(fā)生危害的紅色葉螨(紅蜘蛛)主要是朱砂葉螨(劉映紅等，1995;吳千紅等，1996;王少麗等，2010;盧永宏和楊群芳，2010)，很多教科書也把朱砂葉螨列為蔬菜作物上的優(yōu)勢害螨?；瘜W(xué)防治仍是目前生產(chǎn)上防治葉螨的主要方式，不同種類葉螨對殺螨(蟲)劑的敏感度存在顯著差異 (van Leeuwen et al.，2010)，據(jù)報道，二斑葉螨對殺蟲劑的敏感度比朱砂葉螨或截形葉螨低了4-5 倍，且二斑葉螨具有抗藥性發(fā)展基礎(chǔ)的眾多的解毒酶基因 (Grbic et al.，2011)。因此，防治葉螨首先要弄清楚寄主作物上的葉螨優(yōu)勢種類，然后針對用藥，達到高效防治的目的。

隨著我國各地蔬菜栽培制度的巨大變化，目前蔬菜作物上發(fā)生為害的葉螨種類亟需進一步鑒定明確。為了實現(xiàn)對蔬菜作物葉螨的高效防治，作者于2009-2013年采用定點和非定點方法采集了北京和河北局部地區(qū)的蔬菜葉螨成螨，室內(nèi)采用形態(tài)學(xué)分類及分子生物學(xué)鑒定技術(shù)進行種類鑒定，研究結(jié)果將對進一步明確蔬菜葉螨的種類、葉螨的針對性科學(xué)防治及不同種類葉螨的生物學(xué)研究等工作奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 葉螨樣品定點采集

葉螨定點采集點為茄子 (品種為“圓雜16號”)田，地點在中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所位于北京市海淀區(qū)的試驗基地。采集田塊為面積為200 m2的塑料大棚。田間進行常規(guī)農(nóng)事管理，未施用任何殺蟲劑。

2009-2013年連續(xù)5年分別于6月中旬采集塑料大棚茄子上葉螨樣品，采集方法為:隨機取樣10 株，每株選取中上部葉片上10 頭葉螨，混合為一個樣本。一半活體用于形態(tài)學(xué)鑒定，剩余部分葉螨保存在70%酒精中，之后存于-20 °C 冰箱中備用。

1.2 葉螨樣本非定點采集

2009-2013年連續(xù)5年分別于北京海淀區(qū)、昌平區(qū)、河北張家口、廊坊等地隨機采集田間不同蔬菜寄主上的葉螨雄性成螨和雌性成螨，特別注意增加雄性葉螨的采集數(shù)量，各樣品的采集時間、寄主植物和栽培模式各不相同，采集的葉螨一部分用于形態(tài)學(xué)鑒定使用，剩余部分樣品放入70%酒精中，保存在-20 °C 冰箱中備用。詳見表1。

1.3 葉螨鑒定方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

葉螨樣本在實驗室內(nèi)進行顯微鏡初判斷，之后將體色為紅色的葉螨樣品進行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。2009年、2010年采集葉螨樣本由日本茨城大學(xué)應(yīng)用昆蟲和動物實驗室的葉螨分類專家Tetsuo Gotoh 教授幫助鑒定，2011-2013年采集的葉螨樣本送交南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院的洪曉月教授的實驗室進行鑒定。每批次標(biāo)本至少采用10 頭雄成螨、10 頭雌成螨進行，均采用雄性成螨的外生殖器制作玻片，結(jié)合雌成螨的體色進行形態(tài)學(xué)觀察和種類確定，鑒定方法與崔玉楠等(2013)的方法一致。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用純凈水對酒精內(nèi)保存的葉螨樣品沖洗之后，采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的DNA 提取試劑盒(溶液型)進行單頭葉螨的DNA 提取，具體方法參照說明書進行。引物設(shè)計及種類鑒定的具體方法參照王少麗等(2013)建立的截形葉螨的種類特異性SCAR 分子標(biāo)記(上游引物Fw:5'-GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3'和下游引物Rv:5'-ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3')及其擴增程序進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉螨種類鑒定

采集的葉螨種類于室內(nèi)進行顯微鏡觀察和初步的形態(tài)學(xué)鑒定后，根據(jù)雌成螨的體色，所采集樣本分為兩個體色組:紅色組和黃綠色組(圖1)。黃綠色組葉螨雌成螨為黃綠色，體軀兩側(cè)各有一塊黑斑，其外側(cè)三裂，內(nèi)側(cè)接近體軀中部呈現(xiàn)橫“山”字形，雄性螨與雌成螨體色相同，體軀末端尖削，因此確定為二斑葉螨(洪曉月等，2012)，僅對紅色體色的葉螨進行雄性外生殖器和分子生物學(xué)方法鑒定。對單頭紅色葉螨雄性外生殖器制作切片后顯微鏡下比較，發(fā)現(xiàn)其雄性成螨陽莖端錘微小(直徑1.5μm)，端錘背緣平截狀，末端1/3 處有一輕微凹陷，近側(cè)突起圓鈍，遠側(cè)突起尖利，結(jié)合雌成螨的體色，鑒定為截形葉螨(圖2)(洪曉月等，2012)。

圖1 采集葉螨的黃綠色(左)和紅色雌成螨(右)Fig.1 Yellow-green (Left)and red spider mite (Right)female adult collected in this study

圖2 紅色葉螨雄性成蟲的陽具(100×)Fig.2 The aedeagus of male spider mite

同時，采用上述SCAR 分子標(biāo)記對葉螨試蟲的基因組DNA 進行PCR 擴增，擴增結(jié)果見圖3。由圖3 可以看出，所有紅色組葉螨個體均出現(xiàn)一條303 bp的DNA 條帶，而黃綠色個體和清水作為模板的空白對照中未出現(xiàn)明顯條帶，該引物對是截形葉螨的特異性引物對，對葉螨屬的其它種(二斑葉螨、朱砂葉螨、山楂葉螨、柑橘全爪螨及土耳其斯坦葉螨等)的擴增均未出現(xiàn)任何條帶(王少麗等，2013)，由此證明所采集樣品中紅色體色的葉螨均為截形葉螨。

圖3 SCAR 標(biāo)記引物對葉螨種類的PCR 鑒定Fig.3 PCR identification for the species of spider mite using SCAR primers

2.2 葉螨種類鑒定結(jié)果統(tǒng)計

定點調(diào)查年份內(nèi)于每年6月份定點采集葉螨進行鑒定，結(jié)果表明，連續(xù)5年所采集樣品均為截形葉螨，說明調(diào)查地茄子葉螨的優(yōu)勢種類為截形葉螨(表1)。

非定點調(diào)查地點設(shè)在北京和河北部分地區(qū)(表1)。鑒定結(jié)果表明，2009-2011年間采集地點無論茄果類蔬菜或者豆類蔬菜，葉螨優(yōu)勢種類均為截形葉螨，未見朱砂葉螨、二斑葉螨或者其它葉螨種類。而2012年度除了定點調(diào)查中海淀區(qū)塑料大棚內(nèi)仍為截形葉螨外，其它調(diào)查點則發(fā)生了變化。北京海淀區(qū)溫室茄子上為二斑葉螨，同期昌平區(qū)露地栽培的茄子田調(diào)查初期(5月份)主要為二斑葉螨 (97.14%)，有少量截形葉螨(2.86%)，6月份嚴重為害時期葉螨種類組成相似，以二斑葉螨(96.67%)為主，少量為截形葉螨(3.33%)，而2013年所采集溫室茄子上葉螨全部為二斑葉螨(表2)，說明所調(diào)查溫室和露地茄子田中二斑葉螨是優(yōu)勢種類。

表1 北京和河北部分地區(qū)葉螨采集信息及優(yōu)勢種類鑒定結(jié)果Table 1 Sampling information and identification results of spider mites collected in some areas in Beijing and Hebei

3 結(jié)論與討論

葉螨是蔬菜作物上的重要害螨，其種類多，田間?；旌习l(fā)生。本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定技術(shù)結(jié)合，對采集自北京和河北部分地區(qū)的蔬菜葉螨進行種類調(diào)查與鑒定，結(jié)果表明截形葉螨和二斑葉螨是北京和河北部分地區(qū)蔬菜作物上的優(yōu)勢葉螨種類，所采集葉螨樣品中未見到朱砂葉螨或者其它葉螨種類，與以往研究中朱砂葉螨一直位屬常見蔬菜作物優(yōu)勢種類的觀點(劉映紅等，1995;吳千紅等，1996;盧永宏和楊群芳，2010;王少麗等，2010)不一致。可能存在如下原因:第一，葉螨體型微小，存在變異，形態(tài)鑒定非常困難，部分研究者僅根據(jù)自己的常規(guī)認識或者文獻所述來進行種類判別，可能存在部分的誤判，正如de Mendon?a 等(2011)分析GenBank 中不同葉螨的DNA 序列時，發(fā)現(xiàn)葉螨屬的二斑葉螨、朱砂葉螨、神澤葉螨和截形葉螨最易被誤判;而在最近研究中，朱砂葉螨還被稱為二斑葉螨的紅色型(red type)來進行描述(Sun et al.，2012)，進一步說明朱砂葉螨種的界定尚需要進一步研究;第二，由于采集地點的樣本數(shù)及采集地域有限，可能以朱砂葉螨為害為主的寄主、地點和發(fā)生時期尚未采集到，未來應(yīng)加大采集區(qū)域、寄主植物等進行更多樣本的檢測;第三，葉螨不同種類同域發(fā)生，不同種類之間可能存在種間競爭，競爭取代的結(jié)果導(dǎo)致了目前的種類分布。研究發(fā)現(xiàn)在菜豆寄主上，二斑葉螨比朱砂葉螨的競爭力更強，但在棉花寄主上，朱砂葉螨比二斑葉螨的競爭力更強 (李亞和程立生，2009;2011)。然而，截形葉螨和二斑葉螨、朱砂葉螨彼此之間的競爭力如何尚不明確。但很顯然，不同種類之間競爭力長期發(fā)展會導(dǎo)致不同種類之間的演替。

本研究結(jié)果表明，即使同在北京市海淀區(qū)，采集葉螨的溫室和大棚之間距離約100 m，但是溫室和大棚茄子上的葉螨優(yōu)勢種類卻不同(分別為二斑葉螨和截形葉螨)，說明栽培模式及其周邊環(huán)境可能對葉螨種類存在一定程度的影響。因此，下一步研究中，我們需要在上述栽培模式下，進一步加大蔬菜葉螨種類的采集地點和寄主作物的種類，這樣才可能在更廣泛和代表性意義上明確蔬菜葉螨的主要種類。

不同地點葉螨種類的差異除了與地區(qū)、寄主、栽培模式等因素有關(guān)外，可能還會受到其它因子的影響。本研究發(fā)現(xiàn)2012年度北京昌平區(qū)露地茄子田鄰近果園，據(jù)分析果園中的二斑葉螨在此地區(qū)越冬數(shù)量可能相對較多，溫度合適時首先遷入附近的雜草和菜田進行為害，因此茄子田最早發(fā)現(xiàn)的零星葉螨僅是二斑葉螨，而后5月份和6月份中都采集到了極少量的截形葉螨，比例約在1.02%-9.04%之間，可能是由附近雜草或者其它作物田中遷入過來。另外，2012年度北京海淀區(qū)大棚內(nèi)的茄子和昌平區(qū)露地茄子同是“圓雜16號”品種，但大棚內(nèi)是截形葉螨，而我們在春季茄子定植初期，發(fā)現(xiàn)茄子棚周邊的雜草灰灰菜很多，而灰灰菜上已開始零星發(fā)現(xiàn)截形葉螨，因此，推測當(dāng)茄子苗定植后，截形葉螨很可能是由周邊雜草灰灰菜上的葉螨遷入形成種群。同時，葉螨不同種類之間存在競爭，首先遷入的葉螨占據(jù)了生態(tài)位之后，可能會使得其它種類的葉螨遷入別處。因此，我們推測葉螨種類的這種分布，很可能與所采集田塊周邊環(huán)境中雜草種類和其它作物上發(fā)生的葉螨密切關(guān)聯(lián)，或與首先遷入田間的葉螨種類有關(guān)，而日本學(xué)者還提出田間葉螨種類還可能隨著天敵、農(nóng)事操作等因子進行一定程度的變動(Mori et al.，2008;Gotoh and Mori，2011)。

總之，本研究結(jié)果表明截形葉螨和二斑葉螨是北京和河北部分地區(qū)蔬菜作物上的優(yōu)勢葉螨種類，而二斑葉螨的耐藥性比截形葉螨更強，因此生產(chǎn)實踐中防治葉螨首先應(yīng)該明確其優(yōu)勢種類，在此基礎(chǔ)上進行葉螨的針對性防治。

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