張丹+譚麗+趙冬梅

【摘要】 目的：比較三種方法獲得的精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射的臨床結(jié)局。方法：回顧性分析筆者所在醫(yī)院2011年1月-2012年12月374個(gè)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）治療周期的妊娠結(jié)局，依據(jù)精子來源不同分為三組：射出精液組（A組），經(jīng)皮附睪穿刺和經(jīng)皮睪丸穿刺取精子組（B組），供精組（C組），比較三組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率。結(jié)果：A組的優(yōu)胚率高于C組（P<0.017），三組患者的受精率、卵裂率、臨床妊娠率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：精液、附睪或睪丸精子、供精行ICSI助孕的結(jié)局相近。精子的成熟度、精子的冷凍可能并不影響最終的妊娠率。

【關(guān)鍵詞】 卵胞漿內(nèi)單精子注射； 射出精液； 附睪睪丸精子； 供精； 臨床妊娠率

Comparison of Clinical Outcomes of Intracytoplasmic Sperm Injection Using Three Different Sources of Sperm/ZHANG Dan，TAN Li，ZHAO Dong-mei.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：011-013

【Abstract】 Objective：To compare the clinical outcomes of intracytoplasmic sperm injection （ICSI） using the three different sources of sperm.Method：374 intracytoplasmic sperm injection （ICSI） treatment cycles were analyzed retrospectively in our center from January 2011 to December 2012.They were divided into three groups according to the sperm from different sources： ejaculate group （A group）， percutaneous puncture epididymis and testicular sperm group （group B）， donor sperm group （group C）.Fertilization rate，cleavage rate， excellent embryo rate and clinical pregnancy rate of the three groups were compared.Result： The excellent embryo rate of patients in group A was higher than group C（P<0.017）， difference of patients fertilization rate， cleavage rate， clinical pregnancy rate in the three groups was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion：Semen， epididymal or testicular sperm，donor sperm for ICSI outcome is similar to assisted reproductive.Maturity sperm and frozen sperm may not affect the final pregnancy rate.

【Key words】 Intracytoplasmic sperm injection； Ejaculate； Epididymal testicular sperm； Donor sperm； Clinical pregnancy rate

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450014，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.004

不孕癥夫婦中大約30%是男方因素導(dǎo)致不育而就診的，而其中無精子癥的發(fā)病率高達(dá)10%～15%[1]。卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)是治療男性不育的有效方法[2]，經(jīng)皮附睪穿刺和經(jīng)皮睪丸穿刺取精子及供精為無精子癥患者獲得后代提供了可能。本文對比射出精液、經(jīng)皮附睪穿刺和經(jīng)皮睪丸穿刺取精子、供精行ICSI助孕的結(jié)局，分析不同來源的精子對最終妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對筆者所在醫(yī)院2011年1月-2012年12月374個(gè)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）治療周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行分析，不育原因是嚴(yán)重少弱畸精子癥、無精子癥。依據(jù)精子來源不同分為三組：射出精液組（A組），308個(gè)周期；經(jīng)皮附睪穿刺和經(jīng)皮睪丸穿刺取精子組（B組），41個(gè)周期；供精組（C組），25個(gè)周期。所有無精子癥患者進(jìn)入治療周期前進(jìn)行附睪穿刺或睪丸活檢，以明確附睪或睪丸內(nèi)有無活動(dòng)精子。若有活動(dòng)精子則用附睪或睪丸穿刺所獲精子，若無活動(dòng)精子及不動(dòng)精子則采用精子庫中精子，入組的供精組患者當(dāng)天解凍處理后的精子活率密度均符合ICSI標(biāo)準(zhǔn)。擬定ICSI標(biāo)準(zhǔn)為：男方3次精液常規(guī)檢查至少有2次以上符合以下任一標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重少精癥：一次射精的活精子密度≤2×106/mL；（2）少弱畸精癥：精子密度>2×106/mL，但是<20×106/mL，其活動(dòng)率<40%，同時(shí)a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子<20%，或形態(tài)正常精子<15%；（3）弱畸精癥：精子密度≥20×106/mL，按嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)檢查，形態(tài)正常精子<10%，或a+b級(jí)運(yùn)動(dòng)精子<5%；（4）精液處理后活動(dòng)精子密度<5×106/mL。endprint

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)超排卵 采用促性腺激素激動(dòng)劑（GnRHa）進(jìn)行降調(diào)節(jié)，用FSH或HMG促超排卵，至2個(gè)以上卵泡直徑≥18 mm，肌注hCG10 000單位或艾澤250 μg，36～38 h行陰超介導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵術(shù)。

1.2.2 精液精子獲取 射出精液放入37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中待用，液化后，采用梯度離心法進(jìn)行處理。

1.2.3 PESA或TESA獲取精子 患者取仰臥位， 常規(guī)消毒鋪巾后， 以1%鹽酸利多卡因行局部麻醉。用7號(hào)輸液針頭連接10 mL注射器吸取培養(yǎng)液約1 mL，左手固定一側(cè)附睪、睪丸， 右手持輸液針經(jīng)皮穿刺附睪， 持續(xù)施加負(fù)壓抽吸， 同時(shí)緩慢后退，直至有淡黃渾濁附睪液體抽出，將抽出的附睪液放入培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)的精子。如未抽出液體或未找到活動(dòng)精子，則穿刺對側(cè)附睪。如仍未找到活動(dòng)精子，則行TESE。TESE獲取精子時(shí)麻醉方法同上，固定一側(cè)睪丸后用注射器經(jīng)皮穿刺睪丸抽吸，將抽吸出的曲細(xì)精管置于培養(yǎng)皿中，用注射器針頭撕碎曲細(xì)精管，倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)的精子。PESA或TESA獲取精子的處理采用直接離心法，獲得的沉淀備用。

1.2.4 供精 PESA或TESA未獲取精子及有供精指征的患者，取卵當(dāng)天將供精進(jìn)行37 ℃水浴復(fù)溫后采用梯度離心法處理。

1.2.5 受精、移植及臨床妊娠情況的判定 取卵后3～4 h行ICSI，受精后16～18 h觀察雙原核以確定是否正常受精。取卵后第3天根據(jù)患者的年齡和治療周期數(shù)選擇評(píng)分最高的1～3個(gè)胚胎進(jìn)行移植。移植后14 d測血β–hCG 陽性，移植后30 d腹部B超顯示可見孕囊確定臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較應(yīng)用方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床資料的比較 三組患者的年齡、不孕年限、Gn用量、Gn天數(shù)、移植胚胎數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 三組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及妊娠率的比較 三組患者的受精率、卵裂率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），臨床妊娠率從數(shù)據(jù)上看B組和C組略高于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。A組、B組的優(yōu)胚率要高于C組，經(jīng)過多行多列卡方檢驗(yàn)顯示三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組之間的比較，發(fā)現(xiàn)A組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，1992年卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)誕生，該技術(shù)為治療男性因素導(dǎo)致的不育癥提供了有效的方法[2]。根據(jù)患者的病情，對于梗阻性無精子癥的男性可從附睪或睪丸獲取精子行ICSI助孕，獲得自己的血親后代[3]。若無法從附睪或睪丸獲得精子者則需采用供精試管嬰兒術(shù)助孕。但精液精子、附睪或睪丸精子、供精精子行ICSI治療的臨床結(jié)局如何，是目前普遍關(guān)注的問題。

Bukulmez等[4]比較射出精子組、附睪精子組、睪丸精子組的ICSI結(jié)局，結(jié)果各組間無顯著性差異。研究者認(rèn)為梗阻性無精子癥患者應(yīng)優(yōu)先使用附睪精子行ICSI，并提出男性的配子可能會(huì)影響胚胎的發(fā)育潛能。Dozortsev等[5]則認(rèn)為附睪精子組的受精率比睪丸精子組高，睪丸精子比附睪精子形成的胚胎有更好的發(fā)育潛能。有文獻(xiàn)報(bào)道冷凍精子復(fù)蘇后會(huì)增加精子的DNA損傷[6-7]，影響精子的DNA完整性[8-9]。Bungum等[10]研究認(rèn)為ICSI可繞過精子DNA損傷給精子和卵母細(xì)胞受精時(shí)帶來的損害。國內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道不同來源的精子對結(jié)局沒有明顯影響[11-12]。本研究與其結(jié)局一致。

本研究顯示三組患者的受精率、卵裂率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同的精子來源對ICSI操作后卵子的受精及卵裂無影響?？赡苡捎贗CSI技術(shù)直接將精子注入到卵母細(xì)胞內(nèi)，形成受精卵，對于精子的受精能力要求較低。即使是冷凍復(fù)蘇后的精子，通過ICSI技術(shù)也不會(huì)影響精卵的結(jié)合。Bukulmez等[4]認(rèn)為一旦受精完成后，胚胎的發(fā)育與精子的來源無關(guān)。本研究也顯示出三組患者的卵裂率沒有差異。但射出精子組的優(yōu)胚率從數(shù)據(jù)上看高于附睪或睪丸組和供精組，附睪或睪丸組高于供精組，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步作兩兩比較時(shí)，顯示射出精子組與供精組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），雖然附睪或睪丸組的優(yōu)胚率從數(shù)據(jù)上看高于供精組，但進(jìn)一步比較后顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。射出精子組的優(yōu)胚率從數(shù)據(jù)上看高于附睪或睪丸組，可能由于附睪或睪丸組的精子來源和分離較之射出的精子困難，且ICSI操作過程中要盡量尋找較好的精子進(jìn)行注射導(dǎo)致操作時(shí)間相對較長，致使卵子在外暴露的時(shí)間延長，故其優(yōu)胚率低于射出精子組。有文獻(xiàn)報(bào)道供精的精子行ICSI后優(yōu)胚率低于新鮮精子組[13]。本研究也顯示出供精組的優(yōu)胚率低于射出精子組。可能在精子的冷凍過程中損傷了精子的核染色質(zhì)，中心體，影響了胚胎的正常分裂。但仍需要大樣本的研究進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)。

本研究臨床妊娠率從數(shù)據(jù)上看B組和C組略高于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國內(nèi)的部分研究相一致。附睪或睪丸組和供精組的妊娠率在數(shù)據(jù)上高于射出精子組，可能是由于這兩組患者的女方通常都具有正常的生育能力，其內(nèi)膜擁有正常的允許胚胎著床的能力，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明只要能獲得一定數(shù)量的可移植胚胎，不同來源的精子對ICSI結(jié)局無明顯影響。綜上所述，本研究認(rèn)為只要能夠獲得足夠數(shù)量質(zhì)量較好的胚胎，無論是射出的精子、還是附睪或睪丸精子、供精的精子，對ICSI助孕結(jié)局均無明顯影響。

參考文獻(xiàn)

[1] Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine in collaboration with Society for Male Reproduction and Urology.Evaluation of the azoosperm icmale[J].Fertil Steril，2008，90（5Suppl）：S74-77.endprint

[2] Palermo G， Joris H， Dovroey P，et al.Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoa into an oocyte[J].Lancet，1992，340（8810）：17-18.

[3] Practice Committee of American Society for Reproductive Medicine.Sperm retrieval for obstructive azoospermia[J].Fertil Steril，2008，90（5Suppl）：S213-218.

[4] Bukulmez O，Yu cel A，Yarali H，et al.The origin of spermatozoa does not affect intracytoplasmic sperm injection outcome[J].Eur J 0bstet GynecolReprod Biol，2001，94（2）：250-255.

[5] Dozortsev D， Neme R，Diamond M P，et al.Embryos generated using testicular spermatozoa have higher developmental potential than those obtained using epididymal spermatozoa in men with obstructive azoospermia[J].Fertil Steril，2006，86（3）：606-611.

[6]張建瑞，許成巖.冷凍對人精子核DNA 損傷、凋亡、線粒體膜電位的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，48（1）：49.

[7]李婷婷，方叢.精子質(zhì)量與胚胎質(zhì)量[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（2）：93-97.

[8]袁韋娜，姜宏.精子DNA 損傷與輔助生殖技術(shù)結(jié)局[J].國際生殖健康與計(jì)劃生育雜志，2010，29（4）：285-287.

[9] Di Santo M，Tarozzi N，Nadalini M，et al.Human sperm cryopreservation：update on techniques，effect on DNA integrity，and implications for ART[M].AdvUrol，2012：854837.

[10] Bungum M，Humaidan P，Axmon A，et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome[J].Hum Reprod，2007，22（1）：174-179.

[11]霍雷，金海霞，孫瑩璞，等.不同來源精子行ICSI助孕1662個(gè)周期治療結(jié)局分析[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2011，20（4）：272-278.

[12]馮翠娥，叢林，章志國，等.不同來源精子對卵胞漿內(nèi)單精子注射助孕結(jié)局的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（1）：112-114.

[13]吳昕，劉春蓮，王飛苗，等.精子冷凍損傷與妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2012，34（9）：891-893.

（收稿日期：2014-05-08） （本文編輯：石亞飛）endprint