房青，王在，游嘉，詹雪梅，楊愛蓮，魏繼紅，房昭

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，僅有不到 25% 的卵巢癌能在 I期病變局限于卵巢時(shí)診斷[1]，大多數(shù)患者診斷時(shí)腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移，盡管進(jìn)行了積極的手術(shù)和化療，卵巢癌患者 5年生存率仍不足 30%[2]。人附睪蛋白 4（human epididymis protein 4，HE4），又名 WFDC2（WAP type four disulphide core protein 2），是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因[3]，它在正常卵巢組織中不表達(dá)，而在卵巢癌組織高表達(dá)[4-5]，在卵巢癌患者血清中濃度顯著增高[6]，提示 HE4 可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，HE4 有可能成為卵巢癌輔助診斷和治療的重要靶標(biāo)，但是目前對(duì)HE4 功能的研究較少。本文利用 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，特異性抑制卵巢癌細(xì)胞系 SK-OV-3 中 HE4 基因表達(dá)，觀察 HE4 基因表達(dá)下調(diào)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，為卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系SK-OV-3 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 siRNA 人 HE4 基因特異性小分子干擾RNA（HE4-siRNA）及非特異性序列 siRNA（陰性對(duì)照）購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司。HE4-siRNA 根據(jù)基因庫(kù) GenBank 中人 HE4 mRNA 序列（NM_006103.3，GI:56699494）設(shè)計(jì)，為 3 個(gè) 20 ～25 nt siRNA 雙鏈的混合物，基因序列見表 1。陰性對(duì)照 siRNA（目錄號(hào) sc-37007），為 20～25 nt非特異序列 siRNA。

表1 人 HE4 基因小分子干擾 RNA（HE4-siRNA）序列Table1 Sequences of small interfering RNA targeted human HE4 (HE4-siRNA)

1.1.3 試劑 胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；McCoy’s 5A 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000 和Opti-MEM 培養(yǎng)基為美國(guó) Invitrogen 公司產(chǎn)品；細(xì)胞總 RNA 提取試劑盒 RNeasy Mini Kit 購(gòu)自美國(guó) Qiagen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó) ABI 公司產(chǎn)品；SYBR Premix Ex Taq 購(gòu)自日本 Takara 公司；羊抗人 HE4 蛋白多克隆抗體（sc-27570）、兔抗人 β-actin 多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗羊/兔二抗 IgG 為美國(guó) Santa Cruz 公司產(chǎn)品；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑 ECL 購(gòu)自美國(guó) Pierce 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 CCK8 購(gòu)自日本 Dojindo 公司；人工基底膜基質(zhì)凝膠 Martrigel 和 Transwell小室（裝有碳酸聚酯微孔膜，孔徑 8 μm）購(gòu)自德國(guó) BD Biosciences 公司。

1.1.4 儀器 7700 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) ABI 公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)和 Heraeus Fresc 21 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)為美國(guó) Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞系 SK-OV-3 用含 10% 胎牛血清的 McCoy’s 5A 培養(yǎng)基，在 37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，為上皮細(xì)胞型，貼壁生長(zhǎng)。每 2～3 天 用 0.25% 胰酶和 0.02%EDTA 常規(guī)消化、1∶3～1∶6 傳代培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 SK-OV-3 細(xì)胞 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 SK-OV-3 細(xì)胞接種 6 孔板，5×105個(gè)細(xì)胞/孔，在 37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度約 60% 匯合時(shí)應(yīng)用 LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 siRNA。分組如下：①HE4-siRNA組：轉(zhuǎn)染 3 種人 HE4 序列特異性 siRNA 混合物；②陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染非特異性 siRNA；③正常對(duì)照組：正常培養(yǎng) SK-OV-3，未做轉(zhuǎn)染。具體步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，即用 250 μl 的 Opti-MEM 培養(yǎng)液稀釋 siRNA，終濃度為 40 nmol/L；同時(shí)取 250 μl的 Opti-MEM 培養(yǎng)液和 5 μl LipofectamineTM2000輕柔混勻，室溫孵育 5 min；將以上兩種溶液輕柔混勻，室溫孵育 20 min。將配制的 siRNALipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染混合液加入到 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕搖混勻，培養(yǎng) 6～8 h 后更換含10% 胎牛血清的 McCoy’s 5A 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)HE4 mRNA 表達(dá)水平 siRNA 轉(zhuǎn)染 SK-OV-3 細(xì)胞 48 h 后，按 RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取SK-OV-3 細(xì)胞總 RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度和濃度，取 1 μg 總 RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA。采用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，HE4 引物序列：上游：5' ATAGCACCATGCCTGCT TGT 3'，下游：5' GGGAGTGACACAGGACACCT 3'；內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列：上游：5' CTGCACCACCAACTGCTTAG 3'，下游：5' GAGCTTCCCGTTCAGCTCAG 3'，均由上海英駿生物科技有限公司合成。使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。20 μl 反應(yīng)體系中包括：SYBR Premix Ex Taq（2 ×）10 μl，上下游引物各 0.8 μl，ROX 參比染料（50 ×）0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，無(wú)核酸酶水 6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s、60 ℃ 退火延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè) 2 個(gè)平行管，以 GAPDH 為內(nèi)參照，記錄各樣本的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct），應(yīng)用 2-△△Ct分析目的基因的表達(dá)量。其中 △Ct =CtHE4– CtGAPDH，△△Ct = △CtHE4-siRNA組或陰性對(duì)照組–△Ct空白對(duì)照組。

1.2.4 Western blot 檢測(cè) HE4 蛋白表達(dá)水平 siRNA 轉(zhuǎn)染 SK-OV-3 細(xì)胞 48 h 后，Hanks液沖洗細(xì)胞 2 次，收集細(xì)胞，離心，去上清，細(xì)胞沉淀中加入適量的含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，冰浴裂解 20 min，4 ℃ 條件下，離心半徑8.7 cm，以 12000 r/min 離心 20 min，取上清用BCA 試劑盒（Bradforde 比色法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。行 10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。加入含 5% 脫脂奶粉的封閉液室溫封閉 2 h 后，分別與羊抗人 HE4一抗（1∶200）或 β-actin 一抗（1∶1000）4 ℃ 孵育過(guò)夜，用含 0.05% 吐溫 20 的 TBS 緩沖液充分洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗羊/兔 IgG（1∶10000），室溫孵育 1 h，TBS 洗膜后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色試劑室溫孵育 5 min，X光膠片曝光，拍照。

1.2.5 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 卵巢癌SK-OV-3 細(xì)胞 siRNA 轉(zhuǎn)染 48 h 后，胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，接種 96 孔板，3000 個(gè)/孔，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)不同時(shí)間，加入 10% CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm 處吸光度值，每組設(shè) 5 個(gè)平行樣，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 細(xì)胞侵襲性分析 將 Transwell 小室插入24 孔板內(nèi)，Matrigel 用無(wú)血清的 4 ℃ McCoy’s 5A 培養(yǎng)基稀釋至 8 μg/ml，取 60 μl 稀釋膠加至 Transwell 上室，室溫下干燥后，用無(wú)血清培養(yǎng)基輕洗凝膠 2 次備用。卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞經(jīng) siRNA 轉(zhuǎn)染 48 h 后，胰酶消化，制備濃度為 105/ml 細(xì)胞懸液，加入 Transwell 上室，每孔200 μl，培養(yǎng)液為含 0.1% BSA 的 McCoy’s 5A 培養(yǎng)液；Transwell 下室加入 600 μl 含 10% FBS 的McCoy’s 5A 培養(yǎng)液作為趨化因子，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 12 h。取出小室，用濕棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)濾膜的細(xì)胞和 Matrigel 膠，剝下濾膜，常規(guī) HE 染色。正置顯微鏡（200 ×）觀察并拍照，每片膜隨機(jī)計(jì)數(shù) 6 個(gè)視野內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。每組設(shè) 3 個(gè)平行樣。以如下公式計(jì)算侵襲抑制率。

侵襲抑制率 =（正常對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù) –HE4-siRNA 組穿膜細(xì)胞數(shù)）/正常對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，組間均數(shù)比較采用 t 檢驗(yàn)，以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE4-siRNA 可下調(diào)人卵巢癌細(xì)胞系 SK-OV-3的 HE4 表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組相比，HE4-siRNA 轉(zhuǎn)染組SK-OV-3 細(xì)胞中 HE4 mRNA 水平明顯降低，僅為空白對(duì)照組的12.7%（P < 0.01），而轉(zhuǎn)染非特異序列 siRNA 的陰性對(duì)照組細(xì)胞中 HE4 mRNA 表達(dá)水平與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P > 0.05）。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，HE4 蛋白表達(dá)水平變化與 mRNA 表達(dá)的變化一致（圖 1），表明人卵巢癌細(xì)胞系 SK-OV-3的 HE4 表達(dá)被成功下調(diào)。

圖1 siRNA 轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞中 HE4 表達(dá)的影響（A：實(shí)時(shí)定量檢測(cè) HE4 mRNA 表達(dá)；B：Western blot檢測(cè) HE4 蛋白表達(dá)）Figure1 Effect of siRNA transfection on HE4 expression in SK-OV-3 cells (A: The expression of HE4 mRNA detected by real-time quantitative PCR; B: The expression of HE4 protein detected by Western blot)

2.2 HE4-siRNA 下調(diào)人卵巢癌細(xì)胞系 SK-OV-3的 HE4 表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

采用 CCK8 試劑檢測(cè)各組 SK-OV-3 細(xì)胞增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，HE4-siRNA 轉(zhuǎn)染組 SK-OV-3 細(xì)胞增殖被抑制，僅約為正常對(duì)照組的 60%，而陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖無(wú)顯著變化（圖 2）。

圖2 人卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Figure2 Growth curve of human ovarian cancer cell SK-OV-3

圖3 Transwell 小室模型檢測(cè) siRNA 對(duì)卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞侵襲的影響（200 ×）（A：正常對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：HE4-siRNA 組）Figure3 Effect of siRNA transfection on invasive ability of SK-OV-3 detected by Transwell chamber method (200 ×) (A: Normal control; B: Negative control; C: HE4-siRNA)

2.3 HE4-siRNA 下調(diào)人卵巢癌細(xì)胞系 SK-OV-3的 HE4 表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

Transwell 小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，平均每視野中的穿膜細(xì)胞數(shù)，正常對(duì)照組為（187.4 ±11.17）個(gè)，陰性對(duì)照組為（177.8 ± 9.76）個(gè)，HE4-siRNA 組為（21.8 ± 2.86）個(gè)，與正常對(duì)照組相比，HE4-siRNA 組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著下降（P <0.01），計(jì)算侵襲抑制率為（88.3 ± 2.11）%，而陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖 3，表 2）。

表2 HE4-siRNA 對(duì)卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞侵襲的影響Table2 Effect of HE4-siRNA transfection on invasive ability of SK-OV-3 cells

3 討論

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，美國(guó)2012年 22280 人被診斷為卵巢癌，15500 人死亡[2]，主要原因是卵巢癌早期無(wú)癥狀，僅有不到25% 的卵巢癌能在 I 期病變局限于卵巢時(shí)診斷，大多數(shù)患者診斷時(shí)腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移。2003年，Hellstr?m 等[6]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的卵巢癌標(biāo)記物——HE4（WFDC2），它在正常卵巢組織中不表達(dá)，而在卵巢癌組織和血清中濃度增高，診斷的靈敏度與CA125 類似，但是在與卵巢良性病變鑒別時(shí)特異度比 CA125 更高。

HE4 蛋白核心含有四個(gè)二硫鍵組成的 WAP結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白家族一般具有蛋白酶抑制劑的功能。HE4 最初在附睪上皮被發(fā)現(xiàn)，推測(cè)其功能可能與精子成熟有關(guān)[3]。繼而 cDNA 雜交分析和基因表達(dá)序列分析（SAGE）顯示與正常組織相比，HE4 在卵巢癌組織高表達(dá)，提出 HE4 可能是卵巢癌的潛在標(biāo)記物[4-5]。Hellstr?m 等[6]制備了抗 HE4 的單克隆抗體，建立了檢測(cè)血清 HE4 的方法，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血清 HE4 水平升高，提出HE4 是一個(gè)優(yōu)秀的血清腫瘤標(biāo)記物，有助于卵巢癌早期診斷和與卵巢良性病變的鑒別診斷。此后，HE4檢測(cè)在卵巢癌臨床診治中的研究成為熱點(diǎn)，大量研究表明，HE4 是一個(gè)優(yōu)秀的鑒別卵巢良惡性病變的生物標(biāo)記物[7]，薈萃分析顯示 HE4 鑒別診斷卵巢癌和良性病變混合靈敏度（pooled sensitivity）為0.74，混合特異度（pooled specificity）為 0.87[8]。因此，2009年，F(xiàn)DA 結(jié)合 CA125、HE4 檢測(cè)和絕經(jīng)情況提出了惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)算法（risk of malignancy algorithm，ROMA），用于盆腔腫物的良惡性鑒別，使用該算法，93.8% 的上皮性卵巢癌被正確鑒別診斷[9]。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HE4 水平與卵巢癌 FIGO分期、分級(jí)相關(guān)，HE4 水平升高與卵巢癌侵襲性，預(yù)后不良和總生存率相關(guān)[10-12]。并且 HE4 可用于監(jiān)測(cè)卵巢癌復(fù)發(fā)，Schummer 等[13]研究表明，晚期卵巢癌，經(jīng)過(guò)手術(shù)和化療，在復(fù)發(fā)前 4.5 個(gè)月即有HE4 升高。Plotti 等[14]的前瞻性病例對(duì)照研究顯示，當(dāng)截?cái)嘀禐?70 pmol/L 時(shí)，HE4 監(jiān)測(cè)卵巢癌復(fù)發(fā)的靈敏度為 74%，特異度 100%。

以上對(duì) HE4 的臨床研究提示，HE4 可能參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等多個(gè)環(huán)節(jié)，但對(duì) HE4 基因功能的研究目前尚罕見。RNA干擾是近年來(lái)興起的研究生物基因表達(dá)、調(diào)控與功能的一項(xiàng)新技術(shù)，小分子干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）是長(zhǎng)度為 21～23 個(gè)核苷酸的短雙鏈 RNA，能特異性結(jié)合、降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)序列mRNA，從而阻止或降低 mRNA 的翻譯。本研究中，用脂質(zhì)體法將針對(duì) HE4 基因設(shè)計(jì)的 siRNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞系，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR 和 Western blot 方法分析細(xì)胞內(nèi) HE4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) HE4-siRNA 能有效地特異性下調(diào)卵巢癌細(xì)胞內(nèi) HE4 mRNA 和蛋白表達(dá)，進(jìn)而可以研究 HE4 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的功能。

本研究結(jié)果表明，siRNA 特異性下調(diào) HE4 表達(dá)后，可顯著抑制人卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞增殖，細(xì)胞的增殖活力下降約 40%。體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，40 nmol/L HE4-siRNA 轉(zhuǎn)染卵巢癌 SK-OV-3 細(xì)胞48 h 后，穿膜細(xì)胞數(shù)由正常對(duì)照組的（187.4 ±11.17）個(gè)下降為（21.8 ± 2.86）個(gè)（P < 0.01），侵襲抑制率為（88.3 ± 2.11）%。而同時(shí)轉(zhuǎn)染非特異序列的陰性對(duì)照組和正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。以上結(jié)果表明，有效下調(diào)卵巢癌細(xì)胞 HE4 表達(dá)后，可顯著抑制細(xì)胞增殖和侵襲，提示 HE4 可能在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)起重要作用。以上細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果與 HE4臨床研究相符合。卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟協(xié)同作用的結(jié)果，HE4 在此過(guò)程中具體生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，卵巢癌細(xì)胞 HE4 被特異性抑制后，可有效降低人卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，提示HE4 有可能成為卵巢癌轉(zhuǎn)移防治的潛在靶點(diǎn)。

[1] Das PM, Bast RC Jr.Early detection of ovarian cancer.Biomark Med,2008, 2(3):291-303.

[2] Siegel R, Naishadham D, Jemal A.Cancer statistics, 2013.CA Cancer J Clin, 2013, 63(1):11-30.

[3] Kirchhoff C, Habben I, Ivell R, et al.A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors.Biol Reprod, 1991, 45(2):350-357.

[4] Schummer M, Ng WV, Bumgarner RE, et al.Comparative hybridization of an array of 21,500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas.Gene, 1999, 238(2):375-385.

[5] Hough CD, Sherman-Baust CA, Pizer ES, et al.Large-scale serial analysis of gene expression reveals genes differentially expressed in ovarian cancer.Cancer Res, 2000, 60(22):6281-6287.

[6] Hellstr?m I, Raycraft J, Hayden-Ledbetter M, et al.The HE4(WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma.Cancer Res,2003, 63(13):3695-3700.

[7] Kondalsamy-Chennakesavan S, Hackethal A, Bowtell D, et al.Differentiating stage 1 epithelial ovarian cancer from benign ovarian tumours using a combination of tumour markers HE4, CA 125, and CEA and patient's age.Gynecol Oncol, 2013, 129(3):467-471.

[8] Lin J, Qin J, Sangvatanakul V.Human epididymis protein 4 for differential diagnosis between benign gynecologic disease and ovarian cancer: a systematic review and meta-analysis.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2013, 167(1):81-85.

[9] Moore RG, McMeekin DS, Brown AK, et al.A novel multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass.Gynecol Oncol, 2009, 112(1):40-46.

[10] Trudel D, Têtu B, Grégoire J, et al.Human epididymis protein 4 (HE4)and ovarian cancer prognosis.Gynecol Oncol, 2012, 127(3):511-515.

[11] Kalapotharakos G, Asciutto C, Henic E, et al.High preoperative blood levels of HE4 predicts poor prognosis in patients with ovarian cancer.J Ovarian Res, 2012, 5(1):20.

[12] Steffensen KD, Waldstr?m M, Brandslund I, et al.Prognostic impact of prechemotherapy serum levels of HER2, CA125, and HE4 in ovarian cancer patients.Int J Gynecol Cancer, 2011, 21(6):1040-1047.

[13] Schummer M, Drescher C, Forrest R, et al.Evaluation of ovarian cancer remission markers HE4, MMP7 and Mesothelin by comparison to the established marker CA125.Gynecol Oncol, 2012, 125(1):65-69.

[14] Plotti F, Capriglione S, Terranova C, et al.Does HE4 have a role as biomarker in the recurrence of ovarian cancer? Tumour Biol, 2012,33(6):2117-2123.