聶倩+張直峰+呂建平+閆桂琴

摘要：試驗(yàn)以吸附率與解析率為考察指標(biāo)，比較4種大孔吸附樹脂D101、D4020、AB-8、X-5對(duì)小薊（Cirsium setosum）多糖的純化效果。采用分光光度法測定小薊多糖的含量，用靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附-解析方法從4種樹脂中篩選出最適樹脂，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其純化工藝。結(jié)果表明，AB-8型大孔樹脂為純化小薊多糖的最佳樹脂；其純化最佳工藝條件為：上樣液濃度2.0 mg/mL，上樣量30 mL，流速1.0 mL/min，洗脫劑pH 7.0。在此工藝條件下，AB-8對(duì)小薊多糖的解析率可達(dá)77.93%。

關(guān)鍵詞：小薊（Cirsium setosum）；多糖；大孔吸附樹脂；吸附；解析；純化

中圖分類號(hào)：Q946.3；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4661-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.041

Isolation and Purification of Polysaccharide from Cirsium setosum

by Macroporous Resin

NIE Qian， ZHANG Zhi-feng， LV Jan-ping， YAN Gui-qin

（School of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041004，Shanxi，China）

Abstract： Using adsorption rate and desorption rate as indexes， the purification effects of four macroporous adsorption resin including D101， D4020， AB-8 and X-5 were compared. Spectrometry method were used to determine the content of polysaccharides isolated from Cirsium setosum by static and dynamic adsorption-analytical method with four resins. After screening the optimal resin， the purification process were optimized with orthogonal test and single factors test. The results showed that AB-8 was the optimum macroporous resin for absorbing polysaccharide from Cirsium setosum. The optimum technology conditions were sample concentration of 2 mg/mL， sample volume of 30 mL， flow velocity of 1.0 mL/min and pH value of eluent of 7.0. The desorption rate of polysaccharides from Cirsium setosum reached 77.93% under the optimal conditions.

Key words：Cirsium setosum； macroporous adsorption resin； polysaccharide； adsorption； desorption；purification

小薊（Cirsium setosum）為菊科植物，具有涼血止血，祛淤消腫的功能，可用于治療衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外傷出血、癰腫瘡毒等，是傳統(tǒng)的中藥材，在《本草綱目》、《本草經(jīng)集注》、《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》等中均有記載，其中藥化學(xué)成分有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、蒙花甙、豆甾醇等。小薊在中國分布廣泛，中歐、東歐、俄羅斯東部、日本、朝鮮等地區(qū)亦有分布，資源極其豐富。小薊同時(shí)也可以食用，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是人們喜愛的民間野菜。多糖是存在于植物體內(nèi)的一種天然活性物質(zhì)，因具抗氧化、抗癌、抗病毒、降血糖、抑菌等[1-5]多種活性而被普遍應(yīng)用于保健食品、生物醫(yī)藥、環(huán)保、化妝品等領(lǐng)域[6]。大孔吸附樹脂具有理化穩(wěn)定性高、吸附選擇性強(qiáng)、富集效果好、提取工藝簡便、解析條件溫和、再生簡單、使用周期長、分離效率高、分離得到的有效成分純度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于天然植物中活性成分的提取、分離和純化[7]。大孔吸附樹脂對(duì)于多糖提取是比較理想的吸附劑[8-10]。但是目前國內(nèi)鮮見采用大孔吸附樹脂分離、純化小薊多糖的研究報(bào)道。基于此，本研究對(duì)純化小薊多糖大孔樹脂進(jìn)行了篩選并對(duì)其純化工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以期為小薊資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 試驗(yàn)用小薊：采自臨汾市古縣，洗凈于55 ℃烘干，粉碎后過60～80目篩備用。試劑：石油醚、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚（均為分析純）、葡萄糖、蒽酮、濃硫酸。大孔吸附樹脂：分別為AB-8、D4020、X-5、D101，購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所（均為一級(jí)品）。

1.1.2 儀器 D101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），高速萬能粉碎機(jī)（天津市斯泰儀器有限公司），BS-110S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），H-1850R型離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），HHS-6型電熱恒溫水浴鍋（海寧市新華醫(yī)療器械廠），RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），754型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 粗多糖的制備 稱取小薊粉末60 g，按料液比（g/mL，下同）1∶10加入600 mL蒸餾水，于60 ℃超聲提取30 min，提取液經(jīng)過濾收集，濾渣加入450 mL蒸餾水按上述步驟再次提取1次，合并濾液并濃縮至100 mL，依次經(jīng)石油醚脫脂，氯仿-正丁醇（體積比為5∶1）脫蛋白4次[11]后加入3倍體積的95%乙醇，于4 ℃醇沉過夜，離心，沉淀依次用適量無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，將沉淀真空干燥至恒重，得粗多糖備用。

1.2.2 小薊多糖含量的測定 采用蒽酮—濃硫酸法[12]對(duì)小薊多糖含量進(jìn)行測定。以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品在625 nm處測定吸光度，以葡萄糖溶液的濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=2.85x+0.002 8，R2=0.997 3。

精密稱取干燥后粗多糖20 mg，溶于20 mL蒸餾水中，得1 mg/mL的樣液。按上述方法測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算其多糖含量。

1.2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 將大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h，充分膨脹后，用乙醇洗至洗脫液加3倍量蒸餾水無白色混濁現(xiàn)象，再用蒸餾水洗至無醇味，浸泡于蒸餾水中備用。

1.2.4 大孔樹脂的篩選

1）靜態(tài)吸附[13]與靜態(tài)解析試驗(yàn)。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的4種大孔吸附樹脂各3份，每份2 g，置于250 mL錐形瓶中，并分別加入150 mL一定濃度的多糖樣品溶液，置于搖床，室溫下振蕩吸附360 min，每隔30 min取一次樣，測定其多糖含量，根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算大孔樹脂的吸附量及吸附率。

Q=（C0-Ce）×V1/m （1）

E=（C0-Ce）/C0×100%（2）

公式（1）、（2）中，Q為吸附量（mg/g）；C0為吸附前樣品溶液多糖含量（mg/mL）；Ce為吸附后溶液多糖含量（mg/mL）；V1為提取液體積（mL）；m為樹脂干重（g）；E為吸附率。

將靜態(tài)吸附試驗(yàn)過濾后的大孔吸附樹脂置于250 mL的錐形瓶中，加入150 mL蒸餾水作為洗脫劑，置于搖床振蕩解吸240 min，每隔30 min取一次樣，測定其多糖含量，根據(jù)公式（3）、（4）計(jì)算大孔樹脂的解析量及解析率。

D=C′×V2/m（3）

E′=C′×V2/（C0-Ce）×V1×100%（4）

公式（3）、（4）中，D為解析量（mg/g）；C′為洗脫液中樣品溶液多糖的含量（mg/mL）；V2為洗脫液體積（mL）；E′為解析率。

2）動(dòng)態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)解析試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)過預(yù)處理的4種大孔樹脂，濕法裝柱（1.2 cm×30 cm，層析柱徑高比為1∶25，體積為33.912 cm3），吸取一定濃度（與靜態(tài)吸附試驗(yàn)中的多糖樣品溶液濃度相同）的多糖樣液30 mL，控制流速為1.0 mL/min，待吸附完成后，測定其多糖含量，按照公式（1）、（2）計(jì)算樹脂的吸附量及吸附率。以pH 7.0的蒸餾水作為洗脫劑，采用與吸附試驗(yàn)相同的流速進(jìn)行洗脫，待解析完成后，測定其多糖含量，按照公式（3）、（4）計(jì)算樹脂的解析量及解析率。

1.2.5 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附單因素的確定 按“1.2.4”中動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)的方法濕法裝柱。再分別考察上樣液濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL）、上樣量（10、20、30、40、50、60 mL）、流速（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min）和洗脫劑pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析效果的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化大孔樹脂純化小薊多糖工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以小薊多糖解析率為考察指標(biāo)，分別選取上樣液濃度、上樣量、流速和洗脫劑pH 4個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定大孔樹脂純化小薊多糖的最佳工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

2.1.1 靜態(tài)吸附與靜態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果 由于物化性質(zhì)的不同，各種型號(hào)樹脂對(duì)多糖的吸附及解析能力是不同的。由圖1可知，4種大孔樹脂對(duì)小薊多糖的吸附量均隨吸附時(shí)間的增加呈相似的上升趨勢，且均在270 min時(shí)趨于飽和，至360 min時(shí)均達(dá)飽和平衡狀態(tài)。4種大孔樹脂對(duì)小薊多糖的最終吸附量排序?yàn)椋篨-5>AB-8>D101>D4020。

在篩選最佳樹脂的過程中，需要綜合考慮樹脂的吸附能力，不僅需要吸附能力強(qiáng)，還需要有較強(qiáng)的解析能力才能保證有效成分被最大限度回收[14]。由圖2可知，大孔樹脂靜態(tài)解析曲線趨勢與靜態(tài)吸附曲線的趨勢類似，其對(duì)小薊多糖的解析量均在210 min時(shí)趨于飽和，240 min時(shí)達(dá)平衡飽和狀態(tài)。綜合分析后認(rèn)為AB-8樹脂的解析能力整體較高。4種大孔樹脂對(duì)小薊多糖的最終解析量排序?yàn)椋篈B-8>X-5>D101>D4020。

綜合靜態(tài)吸附與靜態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果如表2。由表2可見，雖然X-5樹脂的吸附率最高，但其解析率最低，僅為60.92%；D4020樹脂的解析率是最高的，但其吸附率卻是最低的，僅為42.78%。綜合考慮剩余的D101和AB-8樹脂，認(rèn)為AB-8樹脂對(duì)小薊多糖的靜態(tài)吸附及解析能力均較強(qiáng)。

2.1.2 動(dòng)態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果 動(dòng)態(tài)吸附及動(dòng)態(tài)解析試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，4種樹脂對(duì)小薊多糖均有較好的動(dòng)態(tài)吸附及解析性能。綜合分析其動(dòng)態(tài)吸附及解析結(jié)果，得出其動(dòng)態(tài)吸附及解析能力排序?yàn)椋篈B-8>D101>D4020>X-5。

比較靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附的結(jié)果，綜合分析后認(rèn)為AB-8樹脂是分離純化小薊多糖的最佳樹脂，且其動(dòng)態(tài)吸附效果優(yōu)于靜態(tài)吸附效果。

2.2 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附單因素的確定

2.2.1 上樣液濃度對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析能力的影響 將小薊多糖的初始濃度分別配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL，上樣量為30 mL，以1.0 mL/min的流速過柱吸附，待充分吸附后，用pH為7.0的洗脫劑進(jìn)行解析，其結(jié)果見圖3。由圖3可見，小薊多糖解析率在上樣液濃度為2.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最高峰，之后其解析率隨上樣液濃度的增加而降低。這是因?yàn)樯蠘右簼舛鹊蜁r(shí)，樹脂未被飽和；上樣液濃度過大時(shí)，小薊多糖向樹脂內(nèi)部擴(kuò)散的速度減慢，堵塞樹脂孔隙從而影響其吸附和解析[15]。因此，上樣液濃度以2.0 mg/mL為宜，此時(shí)，小薊多糖解析率為77.69%。

2.2.2 上樣量對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析能力的影響 分別加入10、20、30、40、50、60 mL樣液過柱，其他條件同“2.2.1”，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解析，其結(jié)果見圖4。由圖4可見，上樣量為30 mL時(shí)，小薊多糖解析率最高，為72.08%；之后隨上樣量的增加小薊多糖解析率逐漸減少。因此，上樣量以30 mL為宜。

2.2.3 流速對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析能力的影響設(shè)定大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析的流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，其他條件同“2.2.1”，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解析，其結(jié)果見圖5。由圖5可見，流速在0.5～1.5 mL/min時(shí)，小薊多糖的解析率隨流速的提高而略有降低。但當(dāng)流速高于1.5 mL/min時(shí)，小薊多糖的解析率下降較多。雖然流速在0.5 mL/min時(shí)小薊多糖的解析率最高，但流速太低，多糖流出速度慢，耗時(shí)長；而流速過快時(shí)，樹脂的交換量降低，從而降低了純化效率，不能完全發(fā)揮出樹脂的吸附能力。因此綜合分析后認(rèn)為以1.5 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解析為宜。

2.2.4 洗脫劑pH對(duì)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解析能力的影響 將洗脫劑pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其他條件同“2.2.1”，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解析，其結(jié)果見圖6。由圖6可見，洗脫劑的pH對(duì)大孔樹脂的解析性能有一定的影響。洗脫劑pH從5.0上升到7.0時(shí)，小薊多糖的解析率呈增加趨勢，且在pH7.0時(shí)達(dá)到最高，為70.72%；但洗脫劑pH從7.0上升到10.0時(shí)，小薊多糖的解析率呈下降趨勢。因此，洗脫劑pH選擇7.0為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可見，各因素對(duì)小薊多糖解析率的影響排序?yàn)锳>B>D>C，即上樣液濃度對(duì)小薊多糖解析率的影響最為明顯，其次為上樣量，洗脫劑pH和流速的影響較小。其最佳工藝組合為A2B2C1D1，即上樣液濃度為2.0 mg/mL，上樣量為30 mL，流速為1.0 mL/min，洗脫劑pH為7.0。

以正交試驗(yàn)所得最佳工藝條件進(jìn)行3次動(dòng)態(tài)吸附驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果小薊多糖的解析率分別為77.97%、78.13%、77.69%，平均為77.93%。表明該純化方法穩(wěn)定可靠且重現(xiàn)性好。

3 小結(jié)與討論

小薊作為2005年《中國藥典》版收載的常用中藥，具有許多醫(yī)用功效。但對(duì)于小薊的研究多集中于對(duì)其化學(xué)成分的研究，對(duì)其有效成分純化的研究較少。楊星昊等[16]進(jìn)行了大孔樹脂純化小薊總黃酮的研究，表明AB-8和HP-20較適合于分離純化小薊總黃酮。但對(duì)小薊多糖成分的提取純化的優(yōu)化鮮見報(bào)道。張海暉等[17]對(duì)板栗殼中原花青素大孔吸附樹脂分離純化工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明AB-8樹脂的效果最佳；付克等[18]運(yùn)用大孔樹脂對(duì)柴芩清肝方提取物進(jìn)行純化，結(jié)果表明AB-8為最佳樹脂；季志紅等[19]運(yùn)用大孔樹脂對(duì)毛頭牛蒡子多糖進(jìn)行了分離純化的工藝研究，結(jié)果表明AB-8的純化效果最佳；宋歌等[20]優(yōu)選大孔吸附樹脂分離純化蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分，結(jié)果表明AB-8有良好的吸附性能；孫明禮[21]對(duì)半枝蓮多糖的脫色劑進(jìn)行篩選并對(duì)其優(yōu)化，結(jié)果表明AB-8有較優(yōu)效果，解析率高達(dá)83.22%；仰榴青等[22]對(duì)大孔吸附樹脂純化銀杏外種皮多糖進(jìn)行了研究，認(rèn)為AB-8吸附性能最好。以上研究結(jié)果均顯示出AB-8有較優(yōu)的吸附和解析效果，這與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致。

影響大孔吸附樹脂分離純化的因素較多，為了達(dá)到較好的分離純化效果，本試驗(yàn)對(duì)大孔樹脂的型號(hào)進(jìn)行了篩選，對(duì)大孔樹脂的吸附和解析的影響因素進(jìn)行了考察。在4種不同型號(hào)的大孔吸附樹脂中AB-8具有較強(qiáng)的吸附和解析能力，為純化小薊多糖的最佳樹脂。正交試驗(yàn)結(jié)果表明4因素對(duì)小薊多糖解析率影響的排序?yàn)锳>B>D>C；其純化最佳工藝條件為：上樣液濃度2.0 mg/mL，上樣量30 mL，流速1.0 mL/min，洗脫劑pH 7.0。在此條件下，AB-8對(duì)小薊多糖的解析率可達(dá)77.93%。通過該工藝，可以有效去除多糖中脂溶性雜質(zhì)等，選擇性地保留有效成分，提高了小薊多糖的純度。且正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可靠、科學(xué)合理且重現(xiàn)性好。為小薊多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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[20] 宋 歌，王寶華，閆興麗，等.蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分大孔樹脂純化工藝的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（3）：200-204.

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