饒 潔，趙利容，羅泊濤，陳小毅

(廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東湛江524023)

鼻咽癌(NPC)是一種與EB病毒感染密切相關(guān)的鼻咽黏膜上皮惡性腫瘤［1］，部分患者起病隱匿、進展快，首診時已有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移［2］，目前侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是威脅NPC患者生命的關(guān)鍵因素之一。腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移是涉及一系列基因變化的復(fù)雜過程［3］，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路家族中的一員，其異常激活與細胞增殖和部分惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP-9)基因表達［4，5］，而 MMPs已被證實在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移起重要作用［6］。本研究觀察了ERK1/2、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和MMP-9蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況，并分析了三者之間的相關(guān)性，旨在為NPC預(yù)后判斷和抗轉(zhuǎn)移治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 75份NPC組織(NPC組)和27份鼻咽黏膜慢性炎組織(炎性組)標本取自2013年1～7月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔蠟塊。NPC組患者中男53例、女22例，年齡25～80歲(中位年齡48.5歲);術(shù)前檢查鼻咽部均可見新生物，表面粗糙不平，觸之易出血，且就診前未接受放療或化療;術(shù)后病理診斷均為鼻咽未分化性非角化型癌(WHOⅡ～Ⅲ級)。炎性組患者中男14例、女13例，年齡23～65歲(中位年齡40.2歲);術(shù)前檢查顯示鼻咽黏膜充血粗糙，局部組織增生，表面光滑;鼻咽組織活檢證實為鼻咽黏膜慢性炎。

1.2 主要試劑 鼠抗人ERK1/2單克隆抗體、兔抗人p-ERK1/2單克隆抗體均購自Cell Signaling公司;兔抗人MMP-9多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 ERK1/2、p-ERK1/2 和 MMP-9 蛋白的檢測方法 采用免疫組織化學(xué)染色法。按SP法試劑盒操作說明檢測石蠟標本ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白的表達，ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9一抗的工作濃度分別為1∶800、1∶400和1∶150。實驗均設(shè)置陽性、陰性和空白對照組，陽性對照用已知陽性組織切片，陰性對照用已知陰性組織切片，空白對照組用PBS代替一抗。ERK1/2主要定位于胞質(zhì)和(或)胞核、p-ERK1/2主要定位于胞核、MMP-9主要定位于胞質(zhì)，陽性表達者呈棕黃色或棕褐色顆粒分布。免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果判斷由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法獨立評估，其中陽性細胞比例在0、1%～9%、10%～50%和51%～100%者分別計為0、1、2和3分，染色強度為不著色、淺黃色、棕黃色和棕褐色者分別計為0、1、2和3分，上述兩種計分乘積＜4判為陰性、≥4判為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，比較采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗;指標間的關(guān)系采用行×列表χ2檢驗相關(guān)法分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種組織中 ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9蛋白表達 NPC組ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9蛋白陽性表達率均顯著高于炎性組(P均＜0.01)，χ2值依次為 19.8、17.1、21.3。詳見表 1。

表1 兩組ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白表達比較

2.2 NPC 組織中 ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9蛋白表達的相關(guān)性 NPC組織中ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白三者間的表達呈正相關(guān)(P均＜0.01)，其中 ERK1/2 與 p-ERK1/2、MMP-9 蛋白的 r值分別為 0.58、0.34(詳見表 2)，p-ERK1/2、MMP-9蛋白的r值為0.34(詳見表3)。

表2 NPC組織中ERK1/2與p-ERK1/2、MMP-9蛋白表達的關(guān)系(例)

表3 NPC組織中p-ERK1/2和MMP-9蛋白表達的關(guān)系(例)

3 討論

NPC是一種由病毒感染、遺傳因素和環(huán)境因素等多種因素相互作用引起的上皮源性惡性腫瘤，其發(fā)病具有顯著的種族和地域特異性，主要好發(fā)于我國南方各省及東南亞地區(qū)，在我國南方各省的發(fā)病率為25/100 000～50/100 000［7］。NPC 的臨床病理學(xué)具有低分化性和高轉(zhuǎn)移性的特點，以局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀就診的病例高達78.9%，侵襲、轉(zhuǎn)移情況是影響患者預(yù)后的主要因素。目前，NPC早期即可發(fā)生組織侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制尚不清楚。在諸多影響癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素中，ERK1/2、p-ERK1/2和 MMP-9倍受關(guān)注，原因為ERK1/2經(jīng)活化后可促進細胞的增殖分化并使具有破壞局部組織結(jié)構(gòu)和降解基底膜屏障等特性的MMP-9蛋白表達增加，進而提高細胞體外移動能力。

ERK1/2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK/ERK通路中兩個重要的成員。在未受刺激的細胞中，ERK1/2位于胞質(zhì)，一旦被激活，則以磷酸化狀態(tài)迅速轉(zhuǎn)移至細胞核，并通過磷酸化反應(yīng)激活某些轉(zhuǎn)錄因子，進而促進細胞增殖分化，抑制細胞凋亡及調(diào)節(jié)血管生成等［8］，其持續(xù)活化最終可促使細胞過度增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在卵巢癌［9］、胃癌［10］、非小細胞性肺癌［11］等多種腫瘤組織中均有ERK1/2高表達、ERK1/2磷酸化增加;Manni等［12］發(fā)現(xiàn)，體外上調(diào)正常乳腺上皮細胞中p-ERK1/2活性可導(dǎo)致其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，推測ERK1/2的活化異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Hauck等［13］用ERK1/2特異性抑制劑PD98059抑制體外肺腺癌中ERK1/2活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生長因子介導(dǎo)的細胞遷移明顯受抑，認為ERK1/2活化可能與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，ERK1/2蛋白及其活化形式p-ERK1/2蛋白陽性表達率在NPC組均顯著高于炎性組。表明NPC組織中存在ERK1/2的持續(xù)激活，ERK1/2可能參與了NPC的惡性轉(zhuǎn)化。

MMP-9是一種鋅離子依賴性內(nèi)切酶，在腫瘤侵襲和血管發(fā)生方面具有獨特功能，可通過破壞局部組織結(jié)構(gòu)促進腫瘤生長和腫瘤新血管形成，并通過降解基底膜屏障促進腫瘤轉(zhuǎn)移。黎聯(lián)等［14］發(fā)現(xiàn)，在肺癌細胞中存在p-ERK1/2和MMP-9蛋白高表達，且使用ERK抑制劑PD98059阻斷ERK信號通路后MMP-9蛋白表達下降;Byun等［15］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中，ERK1/2可通過活化并上調(diào)MMP-9蛋白表達調(diào)控細胞外基質(zhì)降解;Inamoto等［16］也發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑PD98059體外干預(yù)人腎癌細胞可降低氨基丁酸誘導(dǎo)的MMP-9蛋白表達及細胞侵襲能力。故ERK1/2可調(diào)控MMP-9表達。新近研究［17］發(fā)現(xiàn)，在體外 NPC細胞中，亦可通過ERK1/2活化及使MMP-9啟動子活化所需AP-1轉(zhuǎn)錄因子Fra-1的激活，誘導(dǎo)MMP-9的mRNA和蛋白表達增加，促進NPC細胞的侵襲。本研究顯示，MMP-9蛋白在NPC組陽性表達率達顯著高于炎性組，且ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白三者間表達呈正相關(guān)。提示p-ERK1/2可能通過調(diào)節(jié)MMP-9表達參與NPC侵襲、轉(zhuǎn)移，此為NPC臨床治療和預(yù)后評估提供了理論依據(jù)。

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