胡亞男 劉愛東 公培剛 郭江燕 張家穎 尚曉玲 (長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 307)

中樞神經(jīng)免疫性疾病多發(fā)性硬化癥(MS)伴隨髓鞘退化和軸突變性可導(dǎo)致永久性神經(jīng)損傷，以益腎、解毒、通絡(luò)立法的中藥復(fù)方益腎達(dá)絡(luò)飲對MS有較好的治療效果〔1〕。前期研究顯示益腎達(dá)絡(luò)飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)病中致炎因子、P38、β淀粉樣前體蛋白等均有一定影響〔2～4〕。本文應(yīng)用髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)免疫SJL小鼠，構(gòu)建MS實驗動物模型，探討MS的發(fā)病機(jī)制及中藥治療與絲裂原和應(yīng)激激活蛋白酶(MSK1)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8～12周齡的SJL/J雌性小鼠24只，體重18～20 g，由美國Jackson實驗室提供，動物飼養(yǎng)在吉林大學(xué)實驗動物中心。SJL/J小鼠在實驗前清潔飲水，自由飲食。

1.2 實驗藥品與試劑來源 抗原PLP139-151(HSLGKWLGHPDKF)多肽購自北京賽百盛生物工程公司，純度95%以上。百日咳桿菌購自北京生物制品研究所，完全福氏免疫佐劑購自美國sigma公司，醋酸潑尼松購自天津天藥藥業(yè)股份有限公司(批號1006042)。醋酸潑尼松經(jīng)研缽粉碎后以雙蒸水溶解，充分混勻，配成0.039%濃度。4℃保存，使用前混搖均勻。益腎達(dá)絡(luò)飲(由熟地、鹿角膠、梔子、石菖蒲、生甘草等組成)飲片購自長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)常規(guī)方法煎煮后制成2 g生藥/ml的水提物，分裝滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。中藥按每公斤體重20 g生藥量給予小鼠灌胃。SB203580購自美國Sigma公司，用2%二甲基亞楓(DMSO)溶解成1 mmol/L的溶液。Anti-MSK1單抗、anti-CREB單抗購自Cell Signaling公司。辣根過氧化物酶標(biāo)價二抗購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。RIPA蛋白裂解液(中)、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Beyotime公司。PVDF膜為Bio-Rad公司產(chǎn)品。垂直蛋白電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)。半干電轉(zhuǎn)儀為大連競邁生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物模型制備 用PLP139-151抗原免疫小鼠:將100μl PLP139-151 水溶液(含 PLP139-151 150 μg)與 100 μl完全福(氏)免疫佐劑(含結(jié)核桿菌H37RA 400 μg)混合，充分乳化制成油包水的抗原配劑。第1天給予SJL/J小鼠上腹部皮下注射0.2 ml的抗原配劑，第1天和第3天給予靜脈注射0.1 ml(含0.6×106個百日咳桿菌)百日咳桿菌液。

1.4 動物分組及給藥 實驗小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、激素組、中藥組、中藥+激素組、抑制劑組，每組4只。正常組不作任何處理，模型組造模后第7天開始每天給予生理鹽水0.2 ml灌胃14 d，中藥組造模后第7天開始每天按每公斤體重2 g生藥量給予益腎達(dá)絡(luò)飲0.2 ml灌胃14 d，激素組造模后第7天開始每天按每公斤體重0.078 mg藥量給予0.2 ml醋酸潑尼松灌胃14 d;中藥加激素組造模后第7天開始每天按每公斤體重2 g生藥量及0.078 mg醋酸潑尼松給予混合溶液0.2 ml灌胃14 d;SB203580組按照5 mg/kg的藥量腹腔注射 SB203580〔5〕，造模后第7天給藥1次，此后1次/6 d，共給藥3次。

1.5 神經(jīng)功能評價 免疫后所有動物每天稱體重并進(jìn)行神經(jīng)功能評價，動物發(fā)病程度的判斷根據(jù)Kono等〔6〕提出的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病后動物出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，可見動物尾部無力，尾部無力加肢體無力，肢體輕度麻痹，肢體嚴(yán)重麻痹，被動翻身后不能復(fù)原和瀕死狀態(tài)。

1.6 MSK1免疫蛋白質(zhì)印跡法檢測 取造模后22 d時間點小鼠腦標(biāo)本，放入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑)中，使用電動勻漿器低溫條件下勻漿，漿液離心后取上清即得到蛋白溶液。BCA蛋白濃度分析試劑盒測定蛋白濃度。酶標(biāo)儀測定波長為A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。取一定量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后，將凝膠中的蛋白采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉/TBS-T封閉。加入一抗(1∶1 000稀釋)及二抗(1∶5 000稀釋)，SmartChemiⅡ型ECL化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯影，應(yīng)用Image J計算蛋白條帶的灰度值。與內(nèi)參做比值后進(jìn)行分析(以Tubulin為內(nèi)參)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以s表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，經(jīng)One-Way ANOVA進(jìn)行方差齊性檢驗后，選用S-N-K進(jìn)行多組比較。

2 結(jié)果

中藥組、模型組CREB與其余各組相比均顯著升高(P＜0.01)，中藥加激素組高于正常組(P＜0.01)。中藥組、激素組、中藥加激素組、抑制劑組4組的CREB水平由高到低為:中藥組＞激素組＞抑制劑組＞中藥加激素組(兩兩比較P＜0.01)。正常組及中藥加激素組CREB的水平均低于各組，這兩組之間比較均沒有明顯差異(P＞0.05)。

檢測腦組織中MSK1表達(dá)顯示，正常組和中藥組、激素組、抑制劑組均有顯著性差異(均P＜0.01);模型組和激素組、抑制劑組有顯著性差異(均 P＜0.01)，與中藥組有差異(P＜0.05);中藥組和激素組、抑制劑組有顯著性差異(P＜0.01)，與模型組、中藥加激素組有差異(P＜0.05)。見圖1，圖2。

圖1 MSK1、CREB免疫蛋白印跡結(jié)果

圖2 MSK1、CREB灰度值折線圖

3 討論

MS是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為麻木、痙攣、癱瘓、語言障礙、智力障礙及精神癥狀等，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。北京中醫(yī)藥大學(xué)高穎教授的研究團(tuán)隊創(chuàng)立了以益腎、解毒、通絡(luò)立法的中藥復(fù)方益腎達(dá)絡(luò)飲，對MS有較好的療效〔1～4，7〕。EAE 的發(fā)病機(jī)制、病理特點與 MS極為相似，EAE小鼠是研究MS的經(jīng)典動物模型〔5〕。以往研究表明EAE發(fā)病與P38絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)〔1〕，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中P38或ERK激酶通過級聯(lián)磷酸化激活 MSK，MSK直接磷酸化的下游底物還包括CREB、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子以及多個非轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白。MSK是一類核內(nèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK通路的下游媒介分子，參與MAPK信號通路介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳學(xué)調(diào)控。因此，MSK廣泛參與腫瘤轉(zhuǎn)化、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)突觸可塑性等生物學(xué)事件。MSK1作為CREB的上游激酶之一，可使CREB的Ser133的位點磷酸化而激活〔8〕，CREB激活對維持腦損傷后神經(jīng)元的再生、存活及修復(fù)起重要作用〔9，10〕。

SB203580是一種常用的P38 MAPK抑制劑，可以通過細(xì)胞抑制P38 MAPK(p38 MAP kinase)，抑制后續(xù)MAPKAP Kinase-2和MAPKAP Kinase-3的激活。通過抑制P38MAPK，SB203580可以有效抑制一些炎癥因子(如IL-1β、TNF-α)誘導(dǎo)的部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在阻斷P38MAPK信號通路向核內(nèi)傳遞時，一定程度上可以阻止CREB的磷酸化。先前的研究〔7〕表明SB203580能夠明顯降低EAE小鼠的神經(jīng)功能評分，益腎達(dá)絡(luò)飲治療EAE的機(jī)制與調(diào)節(jié)P38MAPK這一細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示中藥和激素、抑制劑均影響MSK1的表達(dá)，EAE發(fā)病中激活P38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，中藥、激素與抑制劑均有治療作用;且呈p38MAPK信號通路下游因子MSK1表達(dá)與及其底物CREB表達(dá)呈相同態(tài)勢，EAE小鼠核蛋白CREB表達(dá)隨P38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活而增加。

中樞神經(jīng)損傷后引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)變化非常復(fù)雜，損傷后的修復(fù)并非由單一信號通路決定，而是多因素多通路錯綜變化的復(fù)雜過程。

1 Shang XL，Gao Y，Yin L，et al.Effects of Yishendaluo decoction on axonal degeneration，inflammatory reaction，and neurological function in a mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis〔J〕.Neural Regen Res，2009;4(11):928-34.

2 尚曉玲，高 穎，尹 嶺，等.益腎達(dá)絡(luò)飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎MCP-1的影響〔J〕.天津中醫(yī)藥，2006;23(5):404-7.

3 尚曉玲，高 穎，尹 嶺，等.益腎達(dá)絡(luò)飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠ICAM-1的影響〔J〕.中醫(yī)藥臨床雜志，2007;19(2):123-5.

4 尚曉玲，高 穎，尹 嶺，等.益腎達(dá)絡(luò)飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎β淀粉樣前體蛋白的影響〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2008;14(9):664-6.

5 Wei S，Benjamin J，Daniel BJ，et al.Drugs designed to inhibit human p38 mitogen-activated protein kinase activation treat toxoplasma gondii and encephalitozoon cuniculi infection〔J〕.Antimicrob Agents Chemother，2007;15(12):4324-8.

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7 高 穎，關(guān)東升，婁麗霞，等.益腎達(dá)絡(luò)飲對實驗性自身免疫性腦脊髓炎p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2011;26(2):267-70.

8 Schiller M，B?hm M，Dennler S，et al.Mitogen-and stress-activated protein kinase 1 is critical for interleukin-1-induced，CREB-mediated，cfos gene expression in keratinocytes〔J〕.Oncogene，2006;25(32):4449-57.

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