李曉曦 孟凡東 孫大鵬 仇鳳啟 劉新莉 趙 丹 馬 萍

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7% ～10%，在美國(guó)乳腺癌的年發(fā)病率已接近130/10萬(wàn)人口〔1〕。在傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物治療是腫瘤治療的新方向。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建靶向鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)除鈣在心血管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用外，在腫瘤的血管形成，侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡方面也有一定作用〔2〕。近年來(lái)，RNA干擾(RNAi)越來(lái)越為人們所重視。RNAi是一種進(jìn)化上保守的基因組水平的免疫監(jiān)控機(jī)制，是多步驟過(guò)程，通過(guò)RNaseⅢ內(nèi)切核酸酶Dicer的作用產(chǎn)生小的(21～23 nt)短干擾性RNA(siR2NA)，介導(dǎo)其互補(bǔ)同源mRNA序列的特異性降解〔3，4〕。本項(xiàng)研究擬利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建表達(dá)CRT shRNA的質(zhì)粒，為研究CRT基因在乳腺癌細(xì)胞株凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移方面的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pGPU6/GFP載體購(gòu)自上海吉瑪公司;限制性內(nèi)切酶 Pst I、BamH I、Bbs I、T4 DNA L Ligase 購(gòu)自美國(guó) NEB 公司;膠回收試劑盒購(gòu)自Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa);質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Axygen。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、大腸桿菌DH5a為本實(shí)驗(yàn)室保存;RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自Boermei公司。

1.2 方法

1.2.1 CRT siRNA轉(zhuǎn)錄模板DNA鏈的設(shè)計(jì)、合成 人CRT mRNA的序列信息從NCBI Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。CRT基因的兩個(gè)靶位置從人CRT mRNA序列中選擇(Genebank Accession NG_029662)，分別選擇CRT編碼序列中第359～379，535～555，747～767，1 051～1 071特異性序列為siRNA的正義鏈。經(jīng)Blast Search檢索確認(rèn)與EGFR以外的人類已知基因序列無(wú)同源性。由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)、合成1#，2#，3#，4#CRT 4對(duì)shRNA。shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號(hào)，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5'端添加了CACC，與BbsI酶切后形成的黏端互補(bǔ);反義鏈模板的5'端添加了GATC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補(bǔ);如果siRNA的第一個(gè)堿基不是G，則在CACC后補(bǔ)加一個(gè)G。序列如下:1#S:5'-CACCGCAGT TCACGGTGA AACATGATT CAAGAGATC ATGTTTCAC CGTGAACTG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCAGTTC ACGGTGAAA CATGATCTC TTGAATCAT GTTTCACCG TGAACTGC-3';2#S:5'-CACCGCAAG AACGTGCTG ATCAACATT CAAGAGATG TTGATCAGC ACGTTCTTG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCAAGAA CGTGCTGAT CAACATCTC TTGAATGTT GATCAGCAC GTTCTTGC-3';3#S:5'-CACCGCCAA GATCGATGA TCCCACATT CAAGAGATG TGGGATCAT CGATCTTGG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCCAAGA TCGATGATC CCACATCTC TTGAATGTG GGATCATCG ATCTTGGC-3';4#S:5'-CACCGCACC ATCTTTGAC AACTTCCTT CAAGAGAGG AAGTTGTCA AAGATGGTG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCACCAT CTTTGACAA CTTCCTCTC TTGAAGGAA GTTGTCAAA GATGGTGC-3'。

1.2.2 重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CRT shRNA的構(gòu)建 將DNA oligo 分別用 TE(pH 8.0)溶解，濃度為 100 μmol/L。按說(shuō)明配比反應(yīng)體系，在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理:95℃ 5 min;85℃ 5 min;75℃ 5 min;70℃ 5 min;4℃保存。退火處理后得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋500倍，終濃度為20 nmol/L，用于連接反應(yīng)。BamHⅠ和BbsⅠ在 37℃ 酶切質(zhì)粒 pGPU6/GFP/Neo 1 h，瓊脂糖凝膠電泳，膠回收線性化質(zhì)粒。用T4連接酶將退火DNA定向插入到空載體中。將重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，每個(gè)連接反應(yīng)挑取5個(gè)菌落，接種到含50 μg/ml Kanamycin的LB培養(yǎng)集中篩選陽(yáng)性克隆，使用堿裂解法抽提質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定 所得質(zhì)粒用BamHⅠ，PstⅠ分別酶切鑒定(圖1)。陽(yáng)性重組載體應(yīng)該可以被BamHⅠ酶切，而不能被PstⅠ酶切。每組選擇兩個(gè)克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃ 飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，適時(shí)換液、傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且存活細(xì)胞百分率均在95%以上時(shí)，用0.25%胰酶消化后鋪6孔板，每孔接種5×105個(gè)細(xì)，隔日進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無(wú)血清RPMI1640 250 μl稀釋4 μg質(zhì)粒載體和10 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑靜置5 min后混合20 min加入6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及總蛋白的提取 收集轉(zhuǎn)染48 h后的MDAMB-231細(xì)胞，以RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 細(xì)胞中CRT蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western印跡法。取提取的5種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白各40 μg，經(jīng)10%SDSPAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過(guò)夜;加入兔抗CRT抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育6 h;TBST洗滌2次，TBS洗滌1次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200稀釋)，37℃孵育2 h;洗膜，ECL發(fā)光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定 pGPU6/GFP/Neo-CRT經(jīng)酶切后電泳，可觀察到在5 000 bp和100 bp左右各有1條帶，符合pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒(5 117 bp)及插入的siRNA片段(58 bp)的特征(見圖1)。

圖1 重組載體的酶切鑒定

2.2 測(cè)序分析 將重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CRT1，pGPU6/GFP/Neo-CRT2，pGPU6/GFP/Neo-CRT3 和 pGPU6/GFP/Neo-CRT4送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果均與目的序列相同。見圖2。

2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果 熒光顯微鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，5種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞中均可見明顯的綠色熒光，表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。見圖3。

2.4 各組細(xì)胞中CRT蛋白的表達(dá) Western印跡法分析顯示，重組質(zhì)粒 pGPU6/GFP/Neo-CRT1，pGPU6/GFP/Neo-CRT2，pGPU6/GFP/Neo-CRT3及 pGPU6/GFP/Neo-CRT4均可抑制MDA-MB-231細(xì)胞中CRT蛋白的表達(dá)，其中pGPU6/GFP/Neo-CRT1質(zhì)粒的抑制作用最為顯著。見圖4。

圖2 測(cè)序分析

圖3 轉(zhuǎn)染MDA-MD-231細(xì)胞圖片(×100)

圖4 Western印跡法分析各組細(xì)胞中CRT蛋白的表達(dá)

3 討論

CRT是一種在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面有作用的多功能蛋白，廣泛分布在有核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面〔5〕，其在防止新蛋白合成過(guò)程中的蛋白聚合和協(xié)助蛋白正確折疊方面有重要作用并有效調(diào)節(jié)體內(nèi) Ca2+的平衡〔6〕。

RNAi是由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。與其他基因沉默技術(shù)相比，其具有高效抑制基因的表達(dá)及高度的序列特異性的優(yōu)點(diǎn)〔8〕。shRNA在體內(nèi)加工后形成類似siRNAs的分子，引發(fā)基因沉默。有研究表明，通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)siRNA并攜帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可以抑制特定基因的表達(dá)〔9，10〕。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)CRT基因設(shè)計(jì)、合成了4對(duì)正、反義RNA干擾寡核苷酸鏈，退火形成雙鏈，與雙酶切的載體pGPU6/GFP連接后轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western印跡技術(shù)檢測(cè)靶基因被抑制的效果，并篩選出了最有效的干擾質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CRT1，避免僅設(shè)計(jì)1組干擾序列導(dǎo)致的干擾效果無(wú)對(duì)照，無(wú)法選擇干擾效率最優(yōu)的質(zhì)粒進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題，從而為進(jìn)一步研究該基因在乳腺癌凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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