魯兵，余萬(wàn)桂 （長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北，荊州434023）

吳國(guó)棟 （荊州市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北，荊州434000）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種發(fā)病于大腸，呈連續(xù)性彌漫分布的非特異性炎性疾病。西方國(guó)家發(fā)病率較高，亞洲國(guó)家相關(guān)較低［1］。近年來(lái)我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率逐年上升，其機(jī)制尚未研究清楚。γ－氨基丁酸（GABA）作為一種異質(zhì)性神經(jīng)遞質(zhì)，主要在突觸參與的興奮／抑制平衡中起重要重用，它在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛［2］，有研究表明GABA在大腸中有表達(dá)。我們的前期研究表明外源性GABA可以影響大鼠大腸運(yùn)動(dòng)功能，導(dǎo)致大鼠大腸平滑肌收縮抑制。構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，對(duì)探討該疾病的發(fā)生、發(fā)展及其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用3%硫酸葡聚糖誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中GABA的濃度以及GABA受體的表達(dá)變化，為探討潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Wistar大鼠17只，體質(zhì)量（175g±15）g，PF級(jí)，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供（動(dòng)物中心許可證號(hào)為SCXK2008－005，動(dòng)物合格證號(hào)：00003033）。飼料由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)。DSS，購(gòu)置于上海西寶生物科技有限公司；GABA、GABAA受體和GABAB受體由SIGMA公司提供；免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物制品有限公司。日本Shimadzu公司的高效液相色譜儀，上海博迅公司的水浴恒溫振蕩器和低溫高速離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與取材 將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組，對(duì)照組每天自由飲用蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組自由飲用含3%DSS的蒸餾水7d誘導(dǎo)建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。所有大鼠經(jīng)烏拉坦麻醉后，斷頭處死，分離結(jié)腸，沿腸系模附著處縱行剪開(kāi)腸壁，觀察大體形態(tài)改變。

1.2.2 γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)液以及樣本液的制作 稱重0.1g大鼠結(jié)腸樣品于100ml三氯乙酸溶液，在40℃水浴中搖蕩120min，冷卻及靜置，低速離心取大腸組織上清液。稱重γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg放置于100ml容器中，蒸餾水定容，可以得到溶度為100mg／ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其稀釋100倍得到濃度為1ug／ml的γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 結(jié)腸組織GABAA受體和GABAB受體免疫組化測(cè)定 石蠟切片按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素襯染，中性樹(shù)膠封固。ImagePro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics，USA）光鏡下（×400）分析免疫組化切片，對(duì)各切片中各抗體不透光率密度（Opacity Density，OD）半定量分析，以O(shè)D數(shù)值代表染色強(qiáng)度，OD數(shù)值越大，染色強(qiáng)度越大。

1.2.4 結(jié)腸組織中GABA含量的測(cè)定

1）色譜條件。Shimadzu公司色譜柱；流動(dòng)相：0.04mol／L乙酸鈉：甲醇＝65∶35；流速1.5ml／min；柱溫36℃；熒光測(cè)儀：發(fā)色波長(zhǎng)為380nm，激發(fā)波長(zhǎng)為250nm，進(jìn)量為30μl，以GABA峰面積來(lái)定量。

2）流動(dòng)相。稱量3.4g三水合乙酸鈉，采用雙蒸水溶解定容至500ml，濾膜過(guò)濾，使用超聲清洗器30min脫氣。

3）衍生試劑的配制。鄰苯二甲醛（OPA）250mg溶解于5ml甲醇中，采用0.5mol／L四硼酸鉀溶液稀釋至150ml，放入2－MCE 200μl，搖勻，放置于4℃冰箱中備用。

4）標(biāo)準(zhǔn)液以及大腸樣液的處理。取1ml樣液及標(biāo)準(zhǔn)液GABA溶液，加入OPA 2ml，反應(yīng)4min，濾膜過(guò)濾至瓶中然后進(jìn)行分析。測(cè)定GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品液密度測(cè)定并計(jì)算出其回收率。

2 結(jié)果

2.1 GABAA受體和GABAB受體的免疫組化表達(dá)

對(duì)照組大鼠結(jié)腸上皮GABAA受體和GABAB受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要定位于腔面頂部和隱窩上皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈零星表達(dá)，棕黃色，此外肌層中肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)纖維亦可涉及。與對(duì)照組比較，模型組潰瘍面上皮脫失，GABAA受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要定位于附近殘存的腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)，以及肉芽組織的間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中，此外肌層中肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)纖維亦可涉及，其表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖1、圖2）。OD數(shù)值明顯升高（P＜0.01），GABAB受體表達(dá)依然零星，與正常組無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組大鼠結(jié)腸GABAA受體和GABAB受體表達(dá)OD值

2.2 GABA濃度測(cè)定結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)GABA溶液與大鼠大腸樣液的分離 在1.5色譜條件下，Shmadzu色相柱上對(duì)衍生的GABA標(biāo)準(zhǔn)品與大鼠樣品組分進(jìn)行了分離。GABA標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為12.328min，模型組大鼠大腸樣品的GABA分離時(shí)間為12.857min，對(duì)照組大鼠大腸樣品的GABA分離時(shí)間為12.795min，大鼠大腸中其他成為不干擾GABA的測(cè)定。

2.2.2 衍生反應(yīng)時(shí)間 OPA試劑與GABA的反應(yīng)程度與衍生反應(yīng)時(shí)間之間存在關(guān)聯(lián)。如衍生反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)不充分，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離產(chǎn)物破壞，會(huì)影響檢測(cè)的精確性。本實(shí)驗(yàn)衍生反應(yīng)時(shí)間確定為2min。

圖1 結(jié)腸組織病理學(xué)改變（HE，×400）

圖2 結(jié)腸組織GABAA受體的表達(dá)（SP，×400）

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)確定 取 GABA標(biāo)準(zhǔn)液配置成濃度為0.2、0.4、0.8、1.6μg／ml。移取1ml與OPA1ml混勻，進(jìn)行分析，縱坐標(biāo)是峰面積，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，其表示出良好的線性關(guān)系，系數(shù)為0.997。

2.2.4 回收率及精密度 在1.5色譜條件下，模型組與對(duì)照組4個(gè)濃度的回收率見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算出日內(nèi)精密度和日間精密度（見(jiàn)表3）。

2.2.5 濃度結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠大腸組織內(nèi)GABA濃度為（698.6±23.5）ng／ml，正常組大鼠大腸組織內(nèi)GABA濃度為（220±15.9）ng／ml，實(shí)驗(yàn)組 GABA 含量為（698.6±23.5）ng／ml，對(duì)照組為（20.0±15.9）ng／ml，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 實(shí)驗(yàn)組與正常組GABA回收率

表3 實(shí)驗(yàn)組與正常組精密度

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種不明原因介導(dǎo)的非特異性炎癥，主要病變部位在結(jié)腸，分布呈連續(xù)彌漫性。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多種因素可引起潰瘍性結(jié)腸炎。目前主流的學(xué)說(shuō)導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的有遺傳學(xué)說(shuō)、環(huán)境學(xué)說(shuō)、微生物學(xué)說(shuō)以及免疫學(xué)說(shuō)，他們之間相互關(guān)聯(lián)［3］。隨著分子生物學(xué)方面的發(fā)展進(jìn)步，潰瘍性結(jié)腸炎在分子水平方面的研究取得很大進(jìn)展。

γ－氨基丁酸作為一種異質(zhì)性神經(jīng)遞質(zhì)，主要在突觸參與的興奮／抑制平衡中起重要重用，它在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛［4］。GABA有三種亞型，分別是GABAA、GABAB以及GABAC三種受體。有研究表明采用免疫組化法研究大腸GABA受體時(shí)三種受體均表達(dá)。我們的前期研究表明外源性GABA可以影響大腸運(yùn)動(dòng)功能，導(dǎo)致大鼠大腸平滑肌收縮抑制。也有大量研究表明外源性GABA還可以影響大腸的分泌功能。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，離體大鼠結(jié)腸，采用高效液相色譜法測(cè)定結(jié)腸中GABA的含量，發(fā)現(xiàn)模型組較正常組大鼠中GABA含量明顯增高。有研究報(bào)道指出，結(jié)腸中GABA受體分為GABA有三種亞型，分別是GABAA、GABAB以及GABAC三種受體。但GABA可以同時(shí)與三種受體相結(jié)合，不同受體與GABA結(jié)合后激活表現(xiàn)出不同的生理作用。GABA作用于大腸主要以GABAA受體激活表現(xiàn)的大腸平滑肌收縮抑制為主。我們前期研究發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

GABA在腦內(nèi)由谷氨酸脫羧經(jīng)由GABA旁路生成，構(gòu)型靈活多變，以兩性離子的形式存在，可與多種受體結(jié)合發(fā)揮多種生理功能。其受體主要可分為兩類：即GABAA受體和GABAB受體［5］。GABA不僅是大腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，還對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的多種組織的形態(tài)發(fā)生及成熟起重要作用［6］。GABA不僅能通過(guò)GABAA受體影響肝細(xì)胞的再生活性［7］，還能影響前列腺癌以及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性［8－9］。GABAB受體則主要在上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起作用［9－10］，亦可在GABA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要作用。在本試驗(yàn)中，可以觀察到GABAA受體和GABAB免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要定位于腔面頂部和隱窩上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色零星表達(dá)，定位與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。在UC模型中，GABAA受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要定位于附近殘存的腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)以及肉芽組織的間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中，此外肌層中肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)纖維亦可涉及，亦與相關(guān)報(bào)道吻合。在UC模型中，GABAA受體表達(dá)增強(qiáng)，GABAB的表達(dá)卻未明顯增強(qiáng)的情況，可能說(shuō)明GABA主要是通過(guò)GABAA受體介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，誘導(dǎo)細(xì)胞膜去極化，抑制DNA合成，從而降低UC上皮細(xì)胞的修復(fù)性增生活性。

總之，通過(guò)本次試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展與GABA密切相關(guān)。GABA主要通過(guò)其GABAA受體參與潰瘍性結(jié)腸炎的病理生理過(guò)程。這對(duì)臨床上針對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的GABA受體陽(yáng)性表達(dá)的患者特異性治療提供了理論依據(jù)。

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