付先蕓　魏紹斌

【摘要】 目的：探討在子宮腺疾?。ˋM）在位及異位子宮內(nèi)膜不同空間部位，中西醫(yī)治療方法對模型小鼠血管生成相關因子的不同影響。方法：對8周齡ICR雌鼠施行雄鼠垂體宮腔內(nèi)移植手術，術后分別飼養(yǎng)3個月，形成模型組。選擇導師行氣化瘀法臨床驗方（蒲靈化瘀止痛方）為實驗藥物（A組），同時將丹莪婦康煎膏作為中藥對照組（B組）、孕三烯酮組為西藥對照組（C組）、未造模同期小鼠為空白組，各組分別給藥3個月。運用免疫組化技術觀察血管生成相關因子（VEGF、CD31、MMP-2）在模型組、用藥組的變化。結果：與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（P<0.05），A、B、C組治療后上調，且A組顯著優(yōu)于B、C組（P<0.05）。與模型組比較，A、B、C組異位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（P<0.05），A、B、C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜MMP-2、VEGF顯著升高（P<0.05）。治療后A、B、C組在位內(nèi)膜MMP-2、VEGF表達與模型組比較均顯著下調（P<0.05），A、B、C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，治療后A、B、C組異位內(nèi)膜MMP-2均顯著下降（P<0.05），C組顯著低于A組及B組（P<0.05）。結論：蒲靈化瘀止痛方可以有效改善在位內(nèi)膜的缺血缺氧狀態(tài)，通過終止疾病的始動環(huán)節(jié)而達到治療該病的目的。在改善局部血供方面，行氣活血中藥與西藥比較有明顯優(yōu)勢。

【關鍵詞】 子宮腺疾病； 小鼠模型； 血管生成相關因子

近幾年的研究顯示，子宮腺肌?。ˋM）的發(fā)病率約為20.9%，近年來其發(fā)病率逐年上升且呈年輕化趨勢，很大部分患者于青少年時期即開始發(fā)生[1-3]。AM患者的妊娠率遠遠低于正常人群（22.2%）[4]。由于病因較為復雜，發(fā)病的確切機制仍不十分清楚，病情遷延反復，臨床難以治愈，多年來一直是臨床和基礎研究重點關注的問題。目前研究顯示子宮內(nèi)膜血管向肌層的浸潤生長是AM發(fā)生的必要條件[5]。中醫(yī)藥治療此病在緩解痛經(jīng)、減少經(jīng)量、改善不孕方面，顯示出了其獨特的優(yōu)勢。本研究引入AM小鼠模型，以血管生成相關因子為觀察靶點，將中藥與西藥的作用機制及治療療效進行比較，為臨床治療提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性未孕ICR小鼠，健康雄性ICR小鼠，鼠齡8～9周，體重為（28±2.5）g，由四川簡陽動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 小鼠同種異體垂體宮腔內(nèi)移植法：（1）腹腔麻醉：選擇3%戊巴比妥鈉作為腹腔麻醉用藥，根據(jù)體重計算，30～35 mg/kg。抽取適量麻醉藥給予8周齡雌鼠腹腔內(nèi)注射。（2）分離雌鼠子宮：8周齡雌鼠，分層切開皮膚層及皮下肌層，在膀胱下找到子宮分叉處。（3）取出雄鼠垂體：8～9周齡ICR雄鼠，處死后開顱取出垂體，混合少許生理鹽水后，置于部分垂體生理鹽水懸濁液約0.5～1 mL于自制套管針頭內(nèi)備用。（4）垂體注射入宮腔內(nèi)：針頭穿刺進入雌鼠右側子宮內(nèi)后，利用套管針內(nèi)芯將垂體生理鹽水懸濁液緩慢推入宮腔，針頭及內(nèi)芯同時退出，將子宮放回腹腔，腹腔內(nèi)滴入慶大霉素溶液0.25 mL（1萬U）預防感染，關腹。

1.2.2 實驗藥物制備 蒲靈化瘀止痛方是導師臨床驗方，全方由蒲黃、五靈脂、制乳香、制沒藥、姜黃、延胡索、三七粉、花蕊石、水蛭、土鱉蟲組成。該方由四川省中醫(yī)院制劑室制成中藥浸膏，儲存于4 ℃冰箱保存。實驗前將中藥浸膏用蒸餾水配成濃度為3.0 g/mL相當于1.2 g原生藥材/20 g體重（28倍于人體常用劑量，按小鼠與人體體表面積折算）。

1.2.3 實驗分組 （1）正常組：未施行手術，常規(guī)飼養(yǎng)3個月。（2）模型組：6只，同種異體垂體移植術后飼養(yǎng)3個月。（3）A組：6只，蒲靈化瘀止痛方組（28倍于人體常用劑量，按照體表面積換算），將中藥浸膏用蒸餾水配成濃度為3.0 g/mL相當于1.2 g原生藥材/20 g體重（28倍于人體常用劑量），每天一次灌胃浸膏稀釋后水溶液0.4 mL/20 g體重。灌胃3個月后處死。（4）B組（丹莪婦康煎膏組）：中藥對照組6只，成人每日用量0.5 g/kg體重，昆明滇虹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，用蒸餾水配成濃度為0.35 mg/mL的水溶液（相當于0.14 g/20 g體重）國藥準字Z20025253。灌胃3個月后處死。（5）C組（孕三烯酮組）：西藥對照組6只，孕三烯酮膠囊，北京紫竹藥業(yè)有限公司，藥準字H19980020用蒸餾水配成濃度為0.02 mg/mL的水溶液。每周2次灌胃孕三烯酮水溶液0.4 mL/20 g體重（相當于8×103 mg/20 g體重）。灌胃3個月后處死。

1.2.4 標本采集與處理方法 于末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死小鼠，立即剖腹取出右側子宮標本置于10%中性福爾馬林液中固定保存；48 h后取出，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（片厚4 ?m）、采用免疫組化SP法染色：用PBS液（0.01 mol/L pH 7.4）沖洗3次，5 min/次；3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；10%的正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加1：100比例稀釋的一抗，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗，沖洗3次，5 min/次；滴加第二代生物素標記二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，沖洗3次，5 min/次；滴加第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，沖洗3次，

5 min/次；DAB顯色劑顯色；自來水充分沖洗，蘇木精復染，封片。

1.3 觀察指標 運用免疫組化技術觀察各組AM小鼠在位及異位子宮內(nèi)膜血管生成相關因子（VEGF、CD31、MMP-2）的變化。endprint

1.4 結果判定 取模實驗小鼠右側子宮縱切面及橫切面切片，一個標本的同一切片顯微鏡下可同時觀察異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜。在光學顯微鏡下分組觀察，在40倍視野下分別找到在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜部位，轉換為100倍視野，觀察子宮內(nèi)膜層腺細胞及間質細胞侵入子宮肌層內(nèi)的情況及浸潤深度。采用Mias圖形分析系統(tǒng)，在200倍視野下分別選擇異位及在位內(nèi)膜組織的被覆上皮中含陽性物質（即棕黃色顆粒物質）最多的5個區(qū)域瀏覽，先測量被覆上皮面積，再測量相應面積中陽性物質的積分光密度，以此表示觀察指標的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD、S-N-K分析和Tamhanes T2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組在位子宮內(nèi)膜CD31、MMP-2、VEGF的比較 與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（P<0.05）。經(jīng)過治療后，A、B、C組CD31表達均有上調趨勢（P<0.05）。與模型組比較，A組CD31表達上調顯著（P<0.05），A組顯著優(yōu)于B、C兩組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜MMP-2、VEGF，顯著升高（P=0.019）。與模型組比較，經(jīng)治療后各組MMP-2表達均下調（A組：P=0.041；B組：P=0.091；C組：P=0.029），VEGF表達均顯著下降（P<0.05），A、B、C組之間比較無差異，見表1。

2.2 各組異位子宮內(nèi)膜CD31、MMP-2、VEGF的比較 與模型組比較，A、B、C組經(jīng)治療后異位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（A組：P=0.018；B組：P=0.031；C組：P=0.004），A、B、C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，治療后A、B、C組異位內(nèi)膜MMP-2均顯著下降（A組：P=0.002；B組：P<0.05；C組：P<0.05），且C組顯著低于B組（P=0.042）及A組（P=0.001），見表2。

3 討論

實驗結果表明，模型組在位內(nèi)膜CD31顯著下降，局部處于缺血缺氧的狀態(tài)，可能為AM發(fā)生的首要觸發(fā)機制，缺氧可以通過HIF-1通路等誘導血管增殖，并可能是誘發(fā)促血管因子上調的最強因素之一[6]。而異位內(nèi)膜CD31及VEGF表達顯著增高，異位內(nèi)膜血管的增殖，為異位病灶的發(fā)生發(fā)展提供了必要的條件[7]。經(jīng)3種方法治療后，在位內(nèi)膜CD31的表達均上升，蒲靈化瘀止痛方組上升顯著，優(yōu)于其他治療組?；钛鲱愔兴幹委煂ρ苌傻亩喟悬c作用的研究表明，活血化瘀中藥能夠直接改善血液流變性、降低血黏度、抗凝、抑制血小板活性、促纖溶、抗血栓、消除微循環(huán)障礙，可以改善血液高凝狀態(tài)，改善局部缺血缺氧狀態(tài)[8]；同時，通過修復血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制其增殖，可能有效改善組織缺血缺氧的“血瘀”狀態(tài)，而消除新生血管生成的條件，通過下調促血管生成因子、誘導內(nèi)皮細胞凋亡、調節(jié)雌激素受體敏感性等多靶點作用，在血管形成前期阻斷病變進一步發(fā)展[9-12]。本實驗中，蒲靈化瘀止痛方組通過改善局部的缺血缺氧狀態(tài)，顯著上調在位CD31水平，下調在位及異位VEGF的異常增高，下調在位及異位MMP-2的異常表達，與現(xiàn)有的研究結果相似[13-14]。在下調血管生成關因子表達方面，中西藥治療組無顯著差異。

綜上所述，與西藥治療相比，蒲靈化瘀止痛方可以有效改善在位內(nèi)膜的缺血缺氧狀態(tài)，通過終止疾病的始動環(huán)節(jié)而控制該病的發(fā)生發(fā)展，從而達到有效緩解痛經(jīng)、減少經(jīng)量的臨床治療效果。在改善局部血供方面，行氣活血中藥與西藥比較有明顯優(yōu)勢。

參考文獻

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[14]李學應，楊廉澤.散結湯治療子宮肌瘤子宮腺肌癥的臨床研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2006，30（4）：365-367.

（收稿日期：2014-05-25） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.4 結果判定 取模實驗小鼠右側子宮縱切面及橫切面切片，一個標本的同一切片顯微鏡下可同時觀察異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜。在光學顯微鏡下分組觀察，在40倍視野下分別找到在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜部位，轉換為100倍視野，觀察子宮內(nèi)膜層腺細胞及間質細胞侵入子宮肌層內(nèi)的情況及浸潤深度。采用Mias圖形分析系統(tǒng)，在200倍視野下分別選擇異位及在位內(nèi)膜組織的被覆上皮中含陽性物質（即棕黃色顆粒物質）最多的5個區(qū)域瀏覽，先測量被覆上皮面積，再測量相應面積中陽性物質的積分光密度，以此表示觀察指標的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD、S-N-K分析和Tamhanes T2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組在位子宮內(nèi)膜CD31、MMP-2、VEGF的比較 與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（P<0.05）。經(jīng)過治療后，A、B、C組CD31表達均有上調趨勢（P<0.05）。與模型組比較，A組CD31表達上調顯著（P<0.05），A組顯著優(yōu)于B、C兩組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜MMP-2、VEGF，顯著升高（P=0.019）。與模型組比較，經(jīng)治療后各組MMP-2表達均下調（A組：P=0.041；B組：P=0.091；C組：P=0.029），VEGF表達均顯著下降（P<0.05），A、B、C組之間比較無差異，見表1。

2.2 各組異位子宮內(nèi)膜CD31、MMP-2、VEGF的比較 與模型組比較，A、B、C組經(jīng)治療后異位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（A組：P=0.018；B組：P=0.031；C組：P=0.004），A、B、C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，治療后A、B、C組異位內(nèi)膜MMP-2均顯著下降（A組：P=0.002；B組：P<0.05；C組：P<0.05），且C組顯著低于B組（P=0.042）及A組（P=0.001），見表2。

3 討論

實驗結果表明，模型組在位內(nèi)膜CD31顯著下降，局部處于缺血缺氧的狀態(tài)，可能為AM發(fā)生的首要觸發(fā)機制，缺氧可以通過HIF-1通路等誘導血管增殖，并可能是誘發(fā)促血管因子上調的最強因素之一[6]。而異位內(nèi)膜CD31及VEGF表達顯著增高，異位內(nèi)膜血管的增殖，為異位病灶的發(fā)生發(fā)展提供了必要的條件[7]。經(jīng)3種方法治療后，在位內(nèi)膜CD31的表達均上升，蒲靈化瘀止痛方組上升顯著，優(yōu)于其他治療組?；钛鲱愔兴幹委煂ρ苌傻亩喟悬c作用的研究表明，活血化瘀中藥能夠直接改善血液流變性、降低血黏度、抗凝、抑制血小板活性、促纖溶、抗血栓、消除微循環(huán)障礙，可以改善血液高凝狀態(tài)，改善局部缺血缺氧狀態(tài)[8]；同時，通過修復血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制其增殖，可能有效改善組織缺血缺氧的“血瘀”狀態(tài)，而消除新生血管生成的條件，通過下調促血管生成因子、誘導內(nèi)皮細胞凋亡、調節(jié)雌激素受體敏感性等多靶點作用，在血管形成前期阻斷病變進一步發(fā)展[9-12]。本實驗中，蒲靈化瘀止痛方組通過改善局部的缺血缺氧狀態(tài)，顯著上調在位CD31水平，下調在位及異位VEGF的異常增高，下調在位及異位MMP-2的異常表達，與現(xiàn)有的研究結果相似[13-14]。在下調血管生成關因子表達方面，中西藥治療組無顯著差異。

綜上所述，與西藥治療相比，蒲靈化瘀止痛方可以有效改善在位內(nèi)膜的缺血缺氧狀態(tài)，通過終止疾病的始動環(huán)節(jié)而控制該病的發(fā)生發(fā)展，從而達到有效緩解痛經(jīng)、減少經(jīng)量的臨床治療效果。在改善局部血供方面，行氣活血中藥與西藥比較有明顯優(yōu)勢。

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[7] Xiao-xia W，Jia-li K，Xue-fei S，et al.Effect of GnRHa on apoptosis and release of VEGF in endometrial cell cultures from patients with adenomyosis[J].Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2012，28（1）：72-73.

[8]付先蕓，魏紹斌，馮婷婷.丹莪婦康煎膏對子宮腺肌瘤小鼠在位及異位內(nèi)膜MMP-2及VEGF表達的不同影響[J].中成藥，2013，35（11）：2523-2525.

[9] Moreira L，De Carvalho E C，Caldas-Bussiere M C.Differential immunohistochemical expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in cow uteri with adenomyosis during follicular phase[J].Vet Res Commun，2011，35（5）：261-269.

[10]呂曉霞，李楠.子宮腺肌病組織中PTTG、bFGF和VEGF的表達及意義[J].山東醫(yī)藥，2008，48（3）：97-98.

[11] Yasumura E G，Stilhano R S，Samoto V Y，et al.Treatment of mouse limb ischemia with an integrative hypoxia-responsive vector expressing the vascular endothelial growth factor gene[J].PLoS One，2012，7（3）：e33 944.

[12]賀豐杰，李小寧，張文婷.凋膜止崩液宮腔靶向給藥對ADUB模型大鼠子宮內(nèi)膜組織中MMP-1、TIMP-1、ER及亞型表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（6）：1861-1863.

[13]李所平.少腹逐瘀湯加味治療子宮腺肌病50例[J].河北中醫(yī)，2009，31（4）：592.

[14]李學應，楊廉澤.散結湯治療子宮肌瘤子宮腺肌癥的臨床研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2006，30（4）：365-367.

（收稿日期：2014-05-25） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.4 結果判定 取模實驗小鼠右側子宮縱切面及橫切面切片，一個標本的同一切片顯微鏡下可同時觀察異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜。在光學顯微鏡下分組觀察，在40倍視野下分別找到在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜部位，轉換為100倍視野，觀察子宮內(nèi)膜層腺細胞及間質細胞侵入子宮肌層內(nèi)的情況及浸潤深度。采用Mias圖形分析系統(tǒng)，在200倍視野下分別選擇異位及在位內(nèi)膜組織的被覆上皮中含陽性物質（即棕黃色顆粒物質）最多的5個區(qū)域瀏覽，先測量被覆上皮面積，再測量相應面積中陽性物質的積分光密度，以此表示觀察指標的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD、S-N-K分析和Tamhanes T2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組在位子宮內(nèi)膜CD31、MMP-2、VEGF的比較 與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（P<0.05）。經(jīng)過治療后，A、B、C組CD31表達均有上調趨勢（P<0.05）。與模型組比較，A組CD31表達上調顯著（P<0.05），A組顯著優(yōu)于B、C兩組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與正常組比較，模型組在位內(nèi)膜MMP-2、VEGF，顯著升高（P=0.019）。與模型組比較，經(jīng)治療后各組MMP-2表達均下調（A組：P=0.041；B組：P=0.091；C組：P=0.029），VEGF表達均顯著下降（P<0.05），A、B、C組之間比較無差異，見表1。

2.2 各組異位子宮內(nèi)膜CD31、MMP-2、VEGF的比較 與模型組比較，A、B、C組經(jīng)治療后異位內(nèi)膜CD31表達顯著下降（A組：P=0.018；B組：P=0.031；C組：P=0.004），A、B、C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與模型組比較，治療后A、B、C組異位內(nèi)膜MMP-2均顯著下降（A組：P=0.002；B組：P<0.05；C組：P<0.05），且C組顯著低于B組（P=0.042）及A組（P=0.001），見表2。

3 討論

實驗結果表明，模型組在位內(nèi)膜CD31顯著下降，局部處于缺血缺氧的狀態(tài)，可能為AM發(fā)生的首要觸發(fā)機制，缺氧可以通過HIF-1通路等誘導血管增殖，并可能是誘發(fā)促血管因子上調的最強因素之一[6]。而異位內(nèi)膜CD31及VEGF表達顯著增高，異位內(nèi)膜血管的增殖，為異位病灶的發(fā)生發(fā)展提供了必要的條件[7]。經(jīng)3種方法治療后，在位內(nèi)膜CD31的表達均上升，蒲靈化瘀止痛方組上升顯著，優(yōu)于其他治療組?；钛鲱愔兴幹委煂ρ苌傻亩喟悬c作用的研究表明，活血化瘀中藥能夠直接改善血液流變性、降低血黏度、抗凝、抑制血小板活性、促纖溶、抗血栓、消除微循環(huán)障礙，可以改善血液高凝狀態(tài)，改善局部缺血缺氧狀態(tài)[8]；同時，通過修復血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制其增殖，可能有效改善組織缺血缺氧的“血瘀”狀態(tài)，而消除新生血管生成的條件，通過下調促血管生成因子、誘導內(nèi)皮細胞凋亡、調節(jié)雌激素受體敏感性等多靶點作用，在血管形成前期阻斷病變進一步發(fā)展[9-12]。本實驗中，蒲靈化瘀止痛方組通過改善局部的缺血缺氧狀態(tài)，顯著上調在位CD31水平，下調在位及異位VEGF的異常增高，下調在位及異位MMP-2的異常表達，與現(xiàn)有的研究結果相似[13-14]。在下調血管生成關因子表達方面，中西藥治療組無顯著差異。

綜上所述，與西藥治療相比，蒲靈化瘀止痛方可以有效改善在位內(nèi)膜的缺血缺氧狀態(tài)，通過終止疾病的始動環(huán)節(jié)而控制該病的發(fā)生發(fā)展，從而達到有效緩解痛經(jīng)、減少經(jīng)量的臨床治療效果。在改善局部血供方面，行氣活血中藥與西藥比較有明顯優(yōu)勢。

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（收稿日期：2014-05-25） （本文編輯：蔡元元）endprint