楊靜慧等

摘 要： 為了解愈傷組織形成單細胞克隆體系的關(guān)鍵因素，以青睞苜蓿為試材，比較了兩種形態(tài)的愈傷組織的生理生化指標和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，兩種類型的愈傷組織細胞膜透性和丙二醛含量無明顯差異；細胞內(nèi)可溶性糖含量和過氧化物酶POD活性差異較大，其中可溶性糖含量為：松散型>巨大型，松散型是巨大型的2.09倍；POD酶活性：巨大型>松散型，巨大型是松散型的1.35倍；巨大型愈傷組織細胞較大、組織排列疏松、細胞高度液泡化、細胞質(zhì)較稀薄，而松散型愈傷組織細胞較小、組織排列松散、細胞液泡較小、細胞質(zhì)較濃。巨大型與松軟型愈傷組織細胞的膜代謝程度相同，但松散型愈傷組織細胞中糖積累多，細胞代謝旺盛；而巨大型愈傷組織糖積累少，細胞衰老。

關(guān)鍵詞：愈傷組織； 形態(tài)結(jié)構(gòu)；生理生化；酶；膜代謝

中圖分類號：S551.7 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.005

Abstract： In order to learn the key factors of callus development on single cell clone， characteristics of physiology and biochemistry and morphological structure of two types of alfalfa callus was studied. The results showed that the cell membrane permeability and malondialdehyde content was same for the two types of callus； but their soluble sugar content and peroxidase activity in cells was very different， for the soluble sugar content： soft callus > huge callus， and soft callus was 2.09 times of huge callus； for peroxidase activity： huge callus > soft callus， and huge callus was 1.35 times of soft callus. Huge callus cells were larger， loosely arranged， cell vacuolization and cytoplasm was thiner than soft callus. However， soft callus cells were smaller， loosely arranged， cell vacuoles was smaller and cytoplasm was thicker than hug callus. Huge cells had the same membrane metabolic with soft cells， but soft cells had higher sugar accumulation than huge cells， and soft cells metabolism were vigorous， while huge cells were more aging.

Key words： callus； morphological structure； physiological and biochemical； enzyme； membrane metabolic

近年來，對于胚性愈傷組織的誘導和體細胞胚的發(fā)生研究取得了較大的進展[1-3]。但是，由許多胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)的體細胞細胞系由于其起源的雜合性，往往缺少穩(wěn)定性[4-5]。而誘導外植體分裂形成形態(tài)結(jié)構(gòu)一致的愈傷組織，即利用均質(zhì)的、松散的愈傷組織可以建立單細胞克隆純系，就具有更好的穩(wěn)定性和非嵌合性[6]。目前，培養(yǎng)這種均質(zhì)的、松散的愈傷組織體系的研究較少[7]。這種單細胞克隆體系與愈傷組織的生理代謝有密切關(guān)系[8]。李茜[6]的研究認為，與愈傷組織的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉含量及抗氧化物酶（POD，SOD ，CAT） 活性有關(guān)。陳超等[9]認為，與SOD、CAT、總谷胱甘肽氧化物酶的活力、超氧化物和丙二醛含量有關(guān)。筆者研究了兩種形態(tài)的愈傷組織的細胞膜透性、丙二醛含量、細胞內(nèi)可溶性糖含量和過氧化物酶POD活性等生理生化變化，比較了他們的形態(tài)差異，研究了具有胚性愈傷組織特點的、均質(zhì)愈傷組織的特性，為單克隆細胞系的建立提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

青睞苜蓿種子來自于中國農(nóng)科院，選取色澤良好飽滿的種子播種于天津農(nóng)學院溫室，播種基質(zhì)為蛭石，獲取實生苗。

在超凈臺中剪取青睞苜蓿實生苗的葉片，將葉片邊緣剪掉，并剪成0.5 cm2的小塊作為外植體，備用。將剪好的外植體消毒，分別接種到1/2 MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 150 mg·L-1 Vc + 15 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上，誘導巨大型愈傷組織；接種到MS + 0.25 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1KT+150 mg·L-1Vc+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上，進行松散型愈傷組織的誘導（詳細見專利201310118903.5）。培養(yǎng)條件為：溫度20～24 ℃，光照強度500～1 000 lx，24 h光照。

獲得的愈傷組織分別進行細胞膜透性（電導率法）、可溶性糖（蒽酮法）、丙二醛含量（硫代巴比妥酸比色法和用Lambda 35紫外分光光度計測定）和POD酶活性（采用愈創(chuàng)木酚比色法和Lambda 35紫外分光光度計測定）測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿兩種愈傷組織細胞膜透性的比較

由圖1可知，苜蓿愈傷組織中巨大型細胞愈傷組織的膜透性為54.30%，松散型細胞的愈傷組織膜透性為54.74%個百分點，僅比巨大型的愈傷組織的細胞膜透性高出0.44個百分點。

2.2 苜蓿兩種類型愈傷組織丙二醛含量的比較

由圖2可知，苜蓿巨大型愈傷組織的丙二醛含量為0.001 406 mol·g-1，松散型的愈傷組織的丙二醛含量為0.001 506 mol·g-1，松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量僅僅高出0.000 1 mol·g-1，基本無差異。

2.3 苜蓿兩種類型愈傷組織可溶性糖含量的比較

由圖3可知，巨大型細胞愈傷組織的可溶性糖含量是0.56%，松散型愈傷組織的可溶性糖含量為1.17%，松散型愈傷組織比巨大型高0.61個百分點，是巨大型的2.09倍，兩者有較大的差異。這一結(jié)果與霍合強[10]的報道一致。

比較兩種愈傷組織的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)（圖1、2）可以看出，巨大型愈傷組織的細胞中含有中央大液泡，液泡化程度遠遠高于松散型愈傷組織，細胞質(zhì)濃度相對來說較低。而松散型愈傷組織細胞中僅有一些小液泡，細胞質(zhì)濃，在細胞中占的比例大。這可能是巨大型愈傷組織細胞中可溶性糖含量低的原因之一。

2.4 苜蓿兩種類型愈傷組織中POD酶活性比較

由圖4可知，巨大型愈傷組織細胞的POD酶活性是6 623.7 U·g-1·min-1，松散型愈傷組織細胞的POD酶活性是4 888.7 U·g-1·min-1，巨大型愈傷組織細胞POD酶活性是松散型的1.35倍，差異較大。

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。過氧化物酶常作為組織老化的一種生理指標[11]。

所以，巨大型愈傷組織細胞的POD酶活性高，表明其組織較松散型愈傷組織老化或衰老程度高。圖1、2的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也表明，巨大型愈傷組織的細胞液泡化程度和細胞的分化程度均較松散型的高，細胞也較大，細胞質(zhì)稀薄、細胞質(zhì)濃度較低，葉綠體等細胞器也較少，代謝活躍程度較低。

總之，巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織在細胞膜透性和丙二醛含量上沒有顯著差異，但在可溶性糖含量和POD酶活性兩項指標上差異比較大，其中松散型愈傷組織的可溶性糖積累高于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈傷組織，即巨大型愈傷組織碳水化合物的積累較少，細胞的衰老程度較高。因此，松散型愈傷組織是代謝更加旺盛的愈傷組織。

3 結(jié)論與討論

巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織的細胞膜透性差異不大（54%～55%），與兩者均為薄壁細胞，且膜代謝反應基本相同有關(guān)。

比較兩種愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1、2）可以看出，松散型愈傷組織細胞呈淺白或白色，半透明，細胞壁??；巨大型愈傷組織細胞呈淺黃色，細胞較大，細胞壁薄。此外，兩種愈傷組織的膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也無差異。說明兩者的生物膜完好程度或生物膜受外界影響的程度也相同。因為丙二醛是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可以作為考察細胞受到脅迫嚴重程度的指標之一，它的主要傷害是導致膜脂過氧化[12]，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，主要是細胞質(zhì)膜，使得細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應的正常進行。因此，兩種愈傷組織的細胞膜透性和丙二醛含量均相同，較一致地說明了兩種愈傷組織膜代謝程度相同，未受到外界的傷害。

參考文獻：

[1] 江榮翠，彭方仁，譚鵬鵬.滇楸體胚發(fā)生及生理生化特性研究[J].林業(yè)科技開發(fā)，2014，28（1）：25-29.

[2] 張建偉，王軍輝，馬建偉.粗枝云杉胚性愈傷組織增殖后期的體細胞胚發(fā)生方式轉(zhuǎn)變[J].植物生理學報， 2014，50（2）：197-202.

[3] 張云超，楊細燕，何良榮，等.魯棉6號體細胞胚胎發(fā)生過程及植株再生[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2014，3（2）：22-27.

[4] 靳小翠，李志輝，楊模華，等.馬尾松幼胚胚性愈傷組織誘導的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報， 2010（4）：80-84.

[5] 冀愛青，彭功波.核桃子葉胚性愈傷組織的誘導[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2010（7）：86-88.

[6] 李茜，張存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈傷組織生理生化特性研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36（8）：151-160.

[7] 苗博瑛，劉艷軍，楊靜慧.黑莓松散型胚性愈傷組織的誘導[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2014，42（3）：209-212，216.

[8] 李家儒，唐曉紅，黃鯤，等.紅豆杉單細胞克隆的建立[J].生物技術(shù)，1996，6（3）：8-10.

[9] 陳超，王桂蘭，陳玉斌.紅掌不同類型愈傷組織及再生團塊生理指標的測定[C]//中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術(shù)年會論文摘要匯編.開封：中國植物生理與分子生物學學會，河南大學， 2009.

[10] 霍合強，鄧秀新.柑桔胚性愈傷組織的誘導、保存和利用[J].植物生理學通訊，2000，36（2）：181-186.

[11] 秦婷婷.油菜子葉衰老時相關(guān)酶類、類囊體膜組分與光譜特性的研究[D].成都：四川大學，2006.

[12] 王梅，丁祥，何素蘭，等.甘薯不同品種葉片中抗氧化相關(guān)活性成分的動態(tài)變化研究[J].西華師范大學學報：自然科學版，2012，33（4）：330-337.

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿兩種愈傷組織細胞膜透性的比較

由圖1可知，苜蓿愈傷組織中巨大型細胞愈傷組織的膜透性為54.30%，松散型細胞的愈傷組織膜透性為54.74%個百分點，僅比巨大型的愈傷組織的細胞膜透性高出0.44個百分點。

2.2 苜蓿兩種類型愈傷組織丙二醛含量的比較

由圖2可知，苜蓿巨大型愈傷組織的丙二醛含量為0.001 406 mol·g-1，松散型的愈傷組織的丙二醛含量為0.001 506 mol·g-1，松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量僅僅高出0.000 1 mol·g-1，基本無差異。

2.3 苜蓿兩種類型愈傷組織可溶性糖含量的比較

由圖3可知，巨大型細胞愈傷組織的可溶性糖含量是0.56%，松散型愈傷組織的可溶性糖含量為1.17%，松散型愈傷組織比巨大型高0.61個百分點，是巨大型的2.09倍，兩者有較大的差異。這一結(jié)果與霍合強[10]的報道一致。

比較兩種愈傷組織的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)（圖1、2）可以看出，巨大型愈傷組織的細胞中含有中央大液泡，液泡化程度遠遠高于松散型愈傷組織，細胞質(zhì)濃度相對來說較低。而松散型愈傷組織細胞中僅有一些小液泡，細胞質(zhì)濃，在細胞中占的比例大。這可能是巨大型愈傷組織細胞中可溶性糖含量低的原因之一。

2.4 苜蓿兩種類型愈傷組織中POD酶活性比較

由圖4可知，巨大型愈傷組織細胞的POD酶活性是6 623.7 U·g-1·min-1，松散型愈傷組織細胞的POD酶活性是4 888.7 U·g-1·min-1，巨大型愈傷組織細胞POD酶活性是松散型的1.35倍，差異較大。

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。過氧化物酶常作為組織老化的一種生理指標[11]。

所以，巨大型愈傷組織細胞的POD酶活性高，表明其組織較松散型愈傷組織老化或衰老程度高。圖1、2的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也表明，巨大型愈傷組織的細胞液泡化程度和細胞的分化程度均較松散型的高，細胞也較大，細胞質(zhì)稀薄、細胞質(zhì)濃度較低，葉綠體等細胞器也較少，代謝活躍程度較低。

總之，巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織在細胞膜透性和丙二醛含量上沒有顯著差異，但在可溶性糖含量和POD酶活性兩項指標上差異比較大，其中松散型愈傷組織的可溶性糖積累高于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈傷組織，即巨大型愈傷組織碳水化合物的積累較少，細胞的衰老程度較高。因此，松散型愈傷組織是代謝更加旺盛的愈傷組織。

3 結(jié)論與討論

巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織的細胞膜透性差異不大（54%～55%），與兩者均為薄壁細胞，且膜代謝反應基本相同有關(guān)。

比較兩種愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1、2）可以看出，松散型愈傷組織細胞呈淺白或白色，半透明，細胞壁??；巨大型愈傷組織細胞呈淺黃色，細胞較大，細胞壁薄。此外，兩種愈傷組織的膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也無差異。說明兩者的生物膜完好程度或生物膜受外界影響的程度也相同。因為丙二醛是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可以作為考察細胞受到脅迫嚴重程度的指標之一，它的主要傷害是導致膜脂過氧化[12]，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，主要是細胞質(zhì)膜，使得細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應的正常進行。因此，兩種愈傷組織的細胞膜透性和丙二醛含量均相同，較一致地說明了兩種愈傷組織膜代謝程度相同，未受到外界的傷害。

參考文獻：

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[2] 張建偉，王軍輝，馬建偉.粗枝云杉胚性愈傷組織增殖后期的體細胞胚發(fā)生方式轉(zhuǎn)變[J].植物生理學報， 2014，50（2）：197-202.

[3] 張云超，楊細燕，何良榮，等.魯棉6號體細胞胚胎發(fā)生過程及植株再生[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2014，3（2）：22-27.

[4] 靳小翠，李志輝，楊模華，等.馬尾松幼胚胚性愈傷組織誘導的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報， 2010（4）：80-84.

[5] 冀愛青，彭功波.核桃子葉胚性愈傷組織的誘導[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2010（7）：86-88.

[6] 李茜，張存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈傷組織生理生化特性研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36（8）：151-160.

[7] 苗博瑛，劉艷軍，楊靜慧.黑莓松散型胚性愈傷組織的誘導[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2014，42（3）：209-212，216.

[8] 李家儒，唐曉紅，黃鯤，等.紅豆杉單細胞克隆的建立[J].生物技術(shù)，1996，6（3）：8-10.

[9] 陳超，王桂蘭，陳玉斌.紅掌不同類型愈傷組織及再生團塊生理指標的測定[C]//中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術(shù)年會論文摘要匯編.開封：中國植物生理與分子生物學學會，河南大學， 2009.

[10] 霍合強，鄧秀新.柑桔胚性愈傷組織的誘導、保存和利用[J].植物生理學通訊，2000，36（2）：181-186.

[11] 秦婷婷.油菜子葉衰老時相關(guān)酶類、類囊體膜組分與光譜特性的研究[D].成都：四川大學，2006.

[12] 王梅，丁祥，何素蘭，等.甘薯不同品種葉片中抗氧化相關(guān)活性成分的動態(tài)變化研究[J].西華師范大學學報：自然科學版，2012，33（4）：330-337.

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿兩種愈傷組織細胞膜透性的比較

由圖1可知，苜蓿愈傷組織中巨大型細胞愈傷組織的膜透性為54.30%，松散型細胞的愈傷組織膜透性為54.74%個百分點，僅比巨大型的愈傷組織的細胞膜透性高出0.44個百分點。

2.2 苜蓿兩種類型愈傷組織丙二醛含量的比較

由圖2可知，苜蓿巨大型愈傷組織的丙二醛含量為0.001 406 mol·g-1，松散型的愈傷組織的丙二醛含量為0.001 506 mol·g-1，松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量僅僅高出0.000 1 mol·g-1，基本無差異。

2.3 苜蓿兩種類型愈傷組織可溶性糖含量的比較

由圖3可知，巨大型細胞愈傷組織的可溶性糖含量是0.56%，松散型愈傷組織的可溶性糖含量為1.17%，松散型愈傷組織比巨大型高0.61個百分點，是巨大型的2.09倍，兩者有較大的差異。這一結(jié)果與霍合強[10]的報道一致。

比較兩種愈傷組織的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)（圖1、2）可以看出，巨大型愈傷組織的細胞中含有中央大液泡，液泡化程度遠遠高于松散型愈傷組織，細胞質(zhì)濃度相對來說較低。而松散型愈傷組織細胞中僅有一些小液泡，細胞質(zhì)濃，在細胞中占的比例大。這可能是巨大型愈傷組織細胞中可溶性糖含量低的原因之一。

2.4 苜蓿兩種類型愈傷組織中POD酶活性比較

由圖4可知，巨大型愈傷組織細胞的POD酶活性是6 623.7 U·g-1·min-1，松散型愈傷組織細胞的POD酶活性是4 888.7 U·g-1·min-1，巨大型愈傷組織細胞POD酶活性是松散型的1.35倍，差異較大。

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。過氧化物酶常作為組織老化的一種生理指標[11]。

所以，巨大型愈傷組織細胞的POD酶活性高，表明其組織較松散型愈傷組織老化或衰老程度高。圖1、2的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也表明，巨大型愈傷組織的細胞液泡化程度和細胞的分化程度均較松散型的高，細胞也較大，細胞質(zhì)稀薄、細胞質(zhì)濃度較低，葉綠體等細胞器也較少，代謝活躍程度較低。

總之，巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織在細胞膜透性和丙二醛含量上沒有顯著差異，但在可溶性糖含量和POD酶活性兩項指標上差異比較大，其中松散型愈傷組織的可溶性糖積累高于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈傷組織，即巨大型愈傷組織碳水化合物的積累較少，細胞的衰老程度較高。因此，松散型愈傷組織是代謝更加旺盛的愈傷組織。

3 結(jié)論與討論

巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織的細胞膜透性差異不大（54%～55%），與兩者均為薄壁細胞，且膜代謝反應基本相同有關(guān)。

比較兩種愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1、2）可以看出，松散型愈傷組織細胞呈淺白或白色，半透明，細胞壁?。痪薮笮陀鷤M織細胞呈淺黃色，細胞較大，細胞壁薄。此外，兩種愈傷組織的膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也無差異。說明兩者的生物膜完好程度或生物膜受外界影響的程度也相同。因為丙二醛是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可以作為考察細胞受到脅迫嚴重程度的指標之一，它的主要傷害是導致膜脂過氧化[12]，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，主要是細胞質(zhì)膜，使得細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應的正常進行。因此，兩種愈傷組織的細胞膜透性和丙二醛含量均相同，較一致地說明了兩種愈傷組織膜代謝程度相同，未受到外界的傷害。

參考文獻：

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[2] 張建偉，王軍輝，馬建偉.粗枝云杉胚性愈傷組織增殖后期的體細胞胚發(fā)生方式轉(zhuǎn)變[J].植物生理學報， 2014，50（2）：197-202.

[3] 張云超，楊細燕，何良榮，等.魯棉6號體細胞胚胎發(fā)生過程及植株再生[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2014，3（2）：22-27.

[4] 靳小翠，李志輝，楊模華，等.馬尾松幼胚胚性愈傷組織誘導的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報， 2010（4）：80-84.

[5] 冀愛青，彭功波.核桃子葉胚性愈傷組織的誘導[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2010（7）：86-88.

[6] 李茜，張存旭，秦萍.白皮松胚性和非胚性愈傷組織生理生化特性研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36（8）：151-160.

[7] 苗博瑛，劉艷軍，楊靜慧.黑莓松散型胚性愈傷組織的誘導[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2014，42（3）：209-212，216.

[8] 李家儒，唐曉紅，黃鯤，等.紅豆杉單細胞克隆的建立[J].生物技術(shù)，1996，6（3）：8-10.

[9] 陳超，王桂蘭，陳玉斌.紅掌不同類型愈傷組織及再生團塊生理指標的測定[C]//中國植物生理學會第十次會員代表大會暨全國學術(shù)年會論文摘要匯編.開封：中國植物生理與分子生物學學會，河南大學， 2009.

[10] 霍合強，鄧秀新.柑桔胚性愈傷組織的誘導、保存和利用[J].植物生理學通訊，2000，36（2）：181-186.

[11] 秦婷婷.油菜子葉衰老時相關(guān)酶類、類囊體膜組分與光譜特性的研究[D].成都：四川大學，2006.

[12] 王梅，丁祥，何素蘭，等.甘薯不同品種葉片中抗氧化相關(guān)活性成分的動態(tài)變化研究[J].西華師范大學學報：自然科學版，2012，33（4）：330-337.