袁勇超+梁旭方+田昌緒+嚴偉+蔡文靜+竇亞琪+易提林

摘要：利用人工催產、人工授精的方法獲得翹嘴鱖（Siniperca chuatsi） （♀）×斑鱖 （Siniperca scherzeri）（♂）雜交子代F1及F1 的自交子代F2，并對翹嘴鱖、斑鱖及其雜交后代F1和F1自交后代F2的胚胎和胚后發(fā)育進行了初步觀察與比較，并采用SSR分子標記方法對翹嘴鱖、斑鱖及其正交子代F1進行了分子鑒定。結果表明，翹嘴鱖卵徑為（1.09±0.05） mm，正交F1雌魚卵徑為（1.26±0.05）mm、F2卵徑（1.19±0.04） mm，顯著小于斑鱖的卵徑（1.83±0.09） mm （P< 0.05）。翹嘴鱖受精卵在水溫23.4～25.1 ℃經過46 h孵化破膜，F1受精卵在水溫23.1～24.8 ℃經過49 h 孵化破膜，F2受精卵在22.6～24.5 ℃經過51 h孵化破膜，斑鱖受精卵在水溫 23.5～25.7 ℃經過107 h孵化破膜。翹嘴鱖、斑鱖、F1和F2初孵仔魚大小分別為（4.06±0.50） mm、（4.58±0.30） mm、（4.21±0.30） mm和（4.14±0.20） mm。采用SSR分子標記方法，根據DNA帶型的不同可以成功鑒別出翹嘴鱖、斑鱖及其雜交子F1。

關鍵詞：翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）;斑鱖（Siniperca scherzeri）;雜交;微衛(wèi)星;鑒定

中圖分類號：S917.4 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4920-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.039

Identification of Embryonic Development Hybrids F1 of Siniperca chuatsi （♀） × Siniperca schezeri （♂） and Its F2

YUAN Yong-chao1， LIANG Xu-fang1，TIAN Chang-xu2，YAN Wei2， CAI Wen-jing2，DOU Ya-qi1，YI Ti-lin1

（1.College of Fisheries/Key Lab of Freshwater Animal Breeding，Ministry of Agriculture/Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation

Center of Hubei Province， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

2.Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： Embryonic and post-embryonic developments were observed and compared in mandarinfish Siniperca chuatsi， spotted mandarinfish Siniperca schezeri and its hybrids F1 and F2 induced to spawn and artificially fertilized at room temperature. The embryonic development of hybrids of Siniperca chuatsi × spotted mandarinfish Siniperca schezeri and their hybrids F1 and F2 were described and compared with each other and their parents. The results showed that in diameter the ?eggs of spotted mandarin fish （1.83±0.09） mm were larger than that of the hybrids F1 [（S. chuatsi （♀） × S. schezeri （♂）] （1.26±0.05） mm， hybrids F2 （1.19±0.04）mm and the mandarin fish （1.09±0.05）mm. The embryos of the mandarin fish， F1 and F2 were hatched in about 46 h at 23.4～25.1 ℃， 49 h at 23.1～24.8 ℃， 51 h at 22.6～24.5 ℃ while the embryos of the spotted mandarinfish were hatched in about 107 h at 23.5～25.7 ℃. Newly hatched mandarin fish， spotted mandarin fish， F1 and F2 larvae were （4.06±0.50） mm， （4.58±0.30） mm， （4.21±0.30） mm， and （4.14±0.20） mm in length， respectively. It is indicated that SSR markers can discriminate well mandarin fish， spotted mandarin fish， and its hybrids.

Key words： Siniperca chuatsi; Siniperca schezeri; hybrid; microsatellite; identification

翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）和斑鱖（Siniperca scherzeri）同隸屬于鱸形目鱖亞科鱖屬。翹嘴鱖和斑鱖肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，是我國傳統(tǒng)的淡水養(yǎng)殖名貴魚類。翹嘴鱖生長速度快，容易發(fā)生病害[1，2]，制約了翹嘴鱖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。自1994年以來，廣東省每年鱖暴發(fā)性流行病發(fā)病率達60%，死亡率為20%～30%。斑鱖是珠江流域的經濟魚類[3]，其肉質鮮美、病害少，但其個體較小，生長速度慢。雜交不僅能豐富遺傳結構，還能使親本的優(yōu)良性狀得到結合，提高雜交后代的生長性能[4]。翹嘴鱖和斑鱖的生物學特性和人工繁殖均有報道[5-9]，研究表明雜交鱖能遺傳親本的某些優(yōu)良生長性狀[10-13]。翹嘴鱖和斑鱖的雜交子代能夠表現出較好的養(yǎng)殖性能及生長性能。翹嘴鱖、斑鱖和雜交子代形態(tài)相似，在育種過程中特別是育苗階段和親本選擇階段，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別方法很難準確地辨別純種和雜交種，因此容易造成種質混雜。

微衛(wèi)星又稱簡單重復序列，均勻分布于真核生物基因組中，由2～6個核苷酸的串聯重復片段構成，具有等位基因數目多、重復性好、共顯性遺傳等特點，被廣泛應用于物種鑒定和基因定位等研究。本研究中對翹嘴鱖和斑鱖的正交子代F1，F1自交子代F2的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育進行了觀察，并對翹嘴鱖、斑鱖及其雜交子代進行了分子鑒定，解決了水產養(yǎng)殖中雜交鱖（翹嘴鱖和斑鱖的雜交子一代）鑒定難和種質混雜的問題，以期為鱖魚及其雜交子代的鑒別提供科學依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗用翹嘴鱖、翹嘴鱖幼體和斑鱖性成熟個體購自于麻城市中和水產開發(fā)有限公司漁場和遼寧省遼陽市遼陽縣興大養(yǎng)殖場。

試驗于2011年6月和2013年5月在麻城市中和水產開發(fā)有限公司漁場進行。正交子代[S. chuatsi（♀）× S. scherzeri（♂）]為不同野生親本的人工繁殖子一代，均分批采自麻城市中和水產開發(fā)有限公司漁場。

1.2 ?人工催產

在2011年和2013年繁殖季節(jié)，通過外源藥物誘導，對翹嘴鱖和斑鱖親魚及其雜交子代F1親本進行人工催產及人工授精，獲得質量較好的受精卵。

1.3 ?胚胎發(fā)育觀察

對翹嘴鱖和斑鱖胚胎及其雜交子代F1和F1自交子代F2的胚胎發(fā)育進行觀察，每隔2 h測量1次水溫;對翹嘴鱖和斑鱖及其雜交子代F1和F1自交子代F2孵出的仔魚進行胚后發(fā)育觀察，仔魚孵出初期，每隔4 h觀察1次，每次隨機抽取10尾魚。中后期根據發(fā)育情況逐漸延長取樣時間間隔，以50%個體出現新特征作為劃分發(fā)育時期的標準，直至8日齡。

1.4 ?基因組DNA的提取

33尾鱖魚（翹嘴鱖親本11尾，斑鱖親本10尾，翹嘴鱖和斑鱖的正交子代F1 12尾）從麻城市中和水產開發(fā)有限公司漁場采得。部分樣本剪少量新鮮尾鰭條，保存于95%乙醇中。利用DNA提取試劑盒從鰭條組織提取基因組DNA，并用紫外分光光度計檢測DNA濃度。

1.5 ?SSR分析

以提取的待測樣品基因組DNA為模板，采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增出DNA目的片段，用于PCR擴增反應的一對微衛(wèi)星引物序列為：上游引物：5′-ATGTAACCGTAAGTGACCTC-3′;下游引物：5′-TGTTGTTCAGACGATGACGA-3′。

PCR反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL， 25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，1.0 mmol/L dNTPs 2.5 μL，上、下游引物各2.0 μL，模板DNA 50～100 ng，Taq DNA聚合酶（5 U/μL ）0.2 μL ，補ddH2O至25 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，反應結束后于4 ℃中保存。將PCR產物以8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，常規(guī)銀染法染色后，拍照記錄電泳結果。

2 ?結果與分析

2.1 ?翹嘴鱖、斑鱖及雜交子代F1胚胎發(fā)育

以翹嘴鱖為母本，斑鱖為父本的正交子代F1及F1自交子代F2魚卵均為非黏性卵，呈淡黃色且透明，在流水中呈漂浮性。受精卵大多數具有1個大油球，有些卵具有數個油球，最多達8個。正交子代F1卵子直徑為（1.26±0.05） mm;F1自交子代F2卵子直徑為（1.19±0. 04） mm;翹嘴鱖卵子直徑為（1.09±0.05） mm;斑鱖卵子直徑為（1.83±0.09） mm。

2.2 ?翹嘴鱖、斑鱖及雜交子代F1的仔魚形態(tài)特征

以翹嘴鱖為母本，斑鱖為父本的正交子代F1剛孵出的仔魚卵黃囊較大，全身透明，可清晰見到血液流動。正交子代F1剛孵出的仔魚全長為 （4.21±0.30） mm;F1自交子代F2剛孵出的仔魚全長為（4.14±0.20） mm;翹嘴鱖剛孵出的仔魚全長為 （4.06±0.05） mm;斑鱖剛孵出的仔魚全長為 （4.58±0.30） mm。翹嘴鱖、斑鱖及其交雜交子代F1胚后發(fā)育形態(tài)特征見表1。

2.3 ?翹嘴鱖、斑鱖及其雜交子代F1的SSR帶譜

采用SSR分子標記方法來鑒別翹嘴鱖、斑鱖及其正交子代F1（圖1）。翹嘴鱖、斑鱖及其雜交子代F1擴增出3種不同的DNA帶型：第一種帶型為翹嘴鱖，在105 bp處擴增出1條特異性DNA條帶;第二種帶型為雜交子代F1，在105 bp和120 bp處各擴增出1條特異性DNA條帶;第三種帶型為斑鱖，在120 bp處擴增出1條特異性DNA條帶。根據DNA帶型的不同即可鑒別出翹嘴鱖、斑鱖及其雜交子代F1。

3 ?小結與討論

本研究中，正交子代F1胚胎發(fā)育時序特征與翹嘴鱖基本相同，在水溫為23.1～24.8 ℃下，胚胎發(fā)育約需經過49 h。F1自交子代F2受精卵在22.6～24.5 ℃經過51 h。這與其他鱖類研究結果基本相似，如翹嘴鱖胚胎半數孵化需時34 h （ 27.2 ℃）[5]; 鴨綠江斑鱖受精后60 h到心跳期，孵化需時約144 h （ 22.2～25. 2 ℃）[14]; 碧流河水庫斑鱖受精后44 h到心跳期，孵化需時約146 h（ 19.0～23.5 ℃）[15]。然而斑鱖與翹嘴鱖雖然同為鱖屬，但其胚胎發(fā)育時序卻不相同。

研究表明，雜種后代的性狀一般偏向于母本，即母本對后代基因有較大的影響力。本研究中在外部條件基本相同的情況下，以翹嘴鱖為母本的雜交鱖胚胎發(fā)育時序均以母本為基準，說明卵細胞在胚胎發(fā)育過程中對胚胎發(fā)育時序、胚胎大小起到了決定性的作用，這可能是卵細胞中的細胞質對生物遺傳性狀有明顯的母性遺傳作用的原因。由此可見，在自然選擇和人工選擇的共同作用下，雙親對后代群體的遺傳貢獻是不均等的[16]。宓國強等[11]利用傳統(tǒng)形態(tài)學和框架分析法分析，發(fā)現翹嘴鱖和斑鱖的雜交子代的形態(tài)性狀偏向母本;三角魴（Megalobrama terminalis）和團頭魴（M. amblycephala）的正、反交雜交后代形態(tài)性狀也存在一定的母性效應[17]。虹鱒Oncorhynchus mykiss（♀）×山女鱒Oncorhynchus masou（♂）雜交F1受精卵與母本的胚胎發(fā)育積溫相當[18]。牙鲆Paralichthys olivaceus（♀）×圓斑星鰈Verasper variegatus（♂）雜交胚胎的發(fā)育過程也與母本相似[19]。

SSR分子標記由于具有高度多態(tài)性、共顯性的孟德爾遺傳方式以及數目巨大且隨機分布的特點，被廣泛應用到性狀分析、群體遺傳分析、進化和種質鑒定等研究中[20]。在利用SSR分子標記進行種質鑒定方面，Jenneckens等[21]用湖鱘LS39引物擴增10種鱘微衛(wèi)星位點，該位點在閃光鱘上獨有且僅有1個110 bp的等位基因，從而與其他9種鱘區(qū)分開。Beacham等[22]應用13個微衛(wèi)星位點區(qū)分了環(huán)太平洋區(qū)不同區(qū)域種群的大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）。微衛(wèi)星是以1～6個核苷酸為基本重復單元的串聯重復序列，其本身重復單元數的變異是物種具有遺傳多態(tài)性的基礎[23]。對于個體而言，某一微衛(wèi)星位點的等位基因數是和該生物的染色體倍性相關的。一般地，對于一個普通二倍體生物個體，由于引物是針對特異的微衛(wèi)星位點設計的，因而每對引物在雜合個體中只能擴增出2條目的條帶，在純合個體中只能擴增1條目的條帶[24]。

參考文獻：

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3 ?小結與討論

本研究中，正交子代F1胚胎發(fā)育時序特征與翹嘴鱖基本相同，在水溫為23.1～24.8 ℃下，胚胎發(fā)育約需經過49 h。F1自交子代F2受精卵在22.6～24.5 ℃經過51 h。這與其他鱖類研究結果基本相似，如翹嘴鱖胚胎半數孵化需時34 h （ 27.2 ℃）[5]; 鴨綠江斑鱖受精后60 h到心跳期，孵化需時約144 h （ 22.2～25. 2 ℃）[14]; 碧流河水庫斑鱖受精后44 h到心跳期，孵化需時約146 h（ 19.0～23.5 ℃）[15]。然而斑鱖與翹嘴鱖雖然同為鱖屬，但其胚胎發(fā)育時序卻不相同。

研究表明，雜種后代的性狀一般偏向于母本，即母本對后代基因有較大的影響力。本研究中在外部條件基本相同的情況下，以翹嘴鱖為母本的雜交鱖胚胎發(fā)育時序均以母本為基準，說明卵細胞在胚胎發(fā)育過程中對胚胎發(fā)育時序、胚胎大小起到了決定性的作用，這可能是卵細胞中的細胞質對生物遺傳性狀有明顯的母性遺傳作用的原因。由此可見，在自然選擇和人工選擇的共同作用下，雙親對后代群體的遺傳貢獻是不均等的[16]。宓國強等[11]利用傳統(tǒng)形態(tài)學和框架分析法分析，發(fā)現翹嘴鱖和斑鱖的雜交子代的形態(tài)性狀偏向母本;三角魴（Megalobrama terminalis）和團頭魴（M. amblycephala）的正、反交雜交后代形態(tài)性狀也存在一定的母性效應[17]。虹鱒Oncorhynchus mykiss（♀）×山女鱒Oncorhynchus masou（♂）雜交F1受精卵與母本的胚胎發(fā)育積溫相當[18]。牙鲆Paralichthys olivaceus（♀）×圓斑星鰈Verasper variegatus（♂）雜交胚胎的發(fā)育過程也與母本相似[19]。

SSR分子標記由于具有高度多態(tài)性、共顯性的孟德爾遺傳方式以及數目巨大且隨機分布的特點，被廣泛應用到性狀分析、群體遺傳分析、進化和種質鑒定等研究中[20]。在利用SSR分子標記進行種質鑒定方面，Jenneckens等[21]用湖鱘LS39引物擴增10種鱘微衛(wèi)星位點，該位點在閃光鱘上獨有且僅有1個110 bp的等位基因，從而與其他9種鱘區(qū)分開。Beacham等[22]應用13個微衛(wèi)星位點區(qū)分了環(huán)太平洋區(qū)不同區(qū)域種群的大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）。微衛(wèi)星是以1～6個核苷酸為基本重復單元的串聯重復序列，其本身重復單元數的變異是物種具有遺傳多態(tài)性的基礎[23]。對于個體而言，某一微衛(wèi)星位點的等位基因數是和該生物的染色體倍性相關的。一般地，對于一個普通二倍體生物個體，由于引物是針對特異的微衛(wèi)星位點設計的，因而每對引物在雜合個體中只能擴增出2條目的條帶，在純合個體中只能擴增1條目的條帶[24]。

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3 ?小結與討論

本研究中，正交子代F1胚胎發(fā)育時序特征與翹嘴鱖基本相同，在水溫為23.1～24.8 ℃下，胚胎發(fā)育約需經過49 h。F1自交子代F2受精卵在22.6～24.5 ℃經過51 h。這與其他鱖類研究結果基本相似，如翹嘴鱖胚胎半數孵化需時34 h （ 27.2 ℃）[5]; 鴨綠江斑鱖受精后60 h到心跳期，孵化需時約144 h （ 22.2～25. 2 ℃）[14]; 碧流河水庫斑鱖受精后44 h到心跳期，孵化需時約146 h（ 19.0～23.5 ℃）[15]。然而斑鱖與翹嘴鱖雖然同為鱖屬，但其胚胎發(fā)育時序卻不相同。

研究表明，雜種后代的性狀一般偏向于母本，即母本對后代基因有較大的影響力。本研究中在外部條件基本相同的情況下，以翹嘴鱖為母本的雜交鱖胚胎發(fā)育時序均以母本為基準，說明卵細胞在胚胎發(fā)育過程中對胚胎發(fā)育時序、胚胎大小起到了決定性的作用，這可能是卵細胞中的細胞質對生物遺傳性狀有明顯的母性遺傳作用的原因。由此可見，在自然選擇和人工選擇的共同作用下，雙親對后代群體的遺傳貢獻是不均等的[16]。宓國強等[11]利用傳統(tǒng)形態(tài)學和框架分析法分析，發(fā)現翹嘴鱖和斑鱖的雜交子代的形態(tài)性狀偏向母本;三角魴（Megalobrama terminalis）和團頭魴（M. amblycephala）的正、反交雜交后代形態(tài)性狀也存在一定的母性效應[17]。虹鱒Oncorhynchus mykiss（♀）×山女鱒Oncorhynchus masou（♂）雜交F1受精卵與母本的胚胎發(fā)育積溫相當[18]。牙鲆Paralichthys olivaceus（♀）×圓斑星鰈Verasper variegatus（♂）雜交胚胎的發(fā)育過程也與母本相似[19]。

SSR分子標記由于具有高度多態(tài)性、共顯性的孟德爾遺傳方式以及數目巨大且隨機分布的特點，被廣泛應用到性狀分析、群體遺傳分析、進化和種質鑒定等研究中[20]。在利用SSR分子標記進行種質鑒定方面，Jenneckens等[21]用湖鱘LS39引物擴增10種鱘微衛(wèi)星位點，該位點在閃光鱘上獨有且僅有1個110 bp的等位基因，從而與其他9種鱘區(qū)分開。Beacham等[22]應用13個微衛(wèi)星位點區(qū)分了環(huán)太平洋區(qū)不同區(qū)域種群的大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）。微衛(wèi)星是以1～6個核苷酸為基本重復單元的串聯重復序列，其本身重復單元數的變異是物種具有遺傳多態(tài)性的基礎[23]。對于個體而言，某一微衛(wèi)星位點的等位基因數是和該生物的染色體倍性相關的。一般地，對于一個普通二倍體生物個體，由于引物是針對特異的微衛(wèi)星位點設計的，因而每對引物在雜合個體中只能擴增出2條目的條帶，在純合個體中只能擴增1條目的條帶[24]。

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