陳敏艷+陳澤忠+王維+朱+鏈+唐宏武++龐代文

摘 要 制備了兩種不同官能團(tuán)修飾的偶聯(lián)親和素的包裹釕聯(lián)吡啶（RuBpy）二氧化硅熒光納米探針A和探針B，并分別用于肝癌細(xì)胞的識(shí)別。通過反相微乳液法制備得到表面修飾不同官能團(tuán)的納米顆粒，然后通過親和素與羧基化包裹RuBpy二氧化硅納米顆粒相互連接而制備得到探針A；通過親和素與PEG修飾的熒光二氧化硅納米顆粒相互作用而制備得到探針B。與探針A不同的是，探針B 通過一個(gè)長鏈PEG分子將親和素與熒光二氧化硅納米顆粒偶聯(lián)在一起。利用免疫熒光成像法將這兩種探針分別用于人肝癌細(xì)胞的識(shí)別，結(jié)果表明，含有長鏈PEG分子的探針B更能夠有效地識(shí)別肝癌細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（CEA）。

關(guān)鍵詞 二氧化硅熒光納米顆粒； 生物偶聯(lián)； 肝癌細(xì)胞； 癌胚抗原

1 引 言

隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種各樣的納米材料已被廣泛應(yīng)用于生物分析、物質(zhì)分離、疾病診斷和治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。熒光納米材料，如半導(dǎo)體熒光量子點(diǎn)、碳點(diǎn)和包裹染料的二氧化硅納米顆粒等，通過表面偶聯(lián)生物功能分子（如抗體或適配體）后，形成具有靶向功能的熒光納米探針，從而應(yīng)用于高靈敏的生物分析[1～7]。生物分析最常用的標(biāo)記材料是有機(jī)熒光分子，但具有易光漂白、生物相容性較差等缺點(diǎn)，極大地限制了其應(yīng)用。為了克服有機(jī)熒光染料的上述缺點(diǎn)，開發(fā)具有光穩(wěn)定性的熒光標(biāo)記材料，成為人們關(guān)注的目標(biāo)。二氧化硅復(fù)合熒光納米顆粒不僅具有良好的生物相容性、表面易修飾、抗光漂白性、低成本、易分離和良好親水性等優(yōu)點(diǎn)[8，9]，而且能夠使核酸酶遠(yuǎn)離固定在其表面的DNA分子，從而保護(hù)DNA免受核酸酶的降解[10～12]。由于抗體能與抗原特異性結(jié)合，目前已有研究將抗體分子偶聯(lián)到二氧化硅納米顆粒制備具有靶向性的熒光納米探針，并將其用于細(xì)菌檢測、癌細(xì)胞識(shí)別和抗原檢測等方面[13～17]。

癌胚抗原（CEA）是一種分子量為180～200 kDa 的多糖蛋白復(fù)合物，屬于腫瘤細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)抗原。CEA 作為一種最常見的腫瘤標(biāo)志物， 被廣泛用作各種消化系腫瘤的診斷及監(jiān)測指標(biāo)[18]。免疫標(biāo)記成像法是一種常見的原位檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，它通過研究細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)部特定生物化學(xué)參數(shù)的變化與差異來實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與檢測，操作簡單、結(jié)果直觀，在癌癥的診斷和轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞膜表面CEA為靶標(biāo)，將包裹釕聯(lián)吡啶（RuBpy）的二氧化硅復(fù)合熒光納米顆粒表面生物功能化，制備成可進(jìn)行生物標(biāo)記的納米探針，分別用于肝癌細(xì)胞LM 9、Huh 7的識(shí)別與成像。與染料分子相比，帶正電荷的RuBpy分子通過靜電作用能夠被穩(wěn)定地束縛在帶有負(fù)電荷的二氧化硅矩陣?yán)?，二氧化硅殼層的保護(hù)使自由氧不能接近熒光染料分子。同時(shí)，大量的染料分子被包裹在二氧化硅納米顆粒核內(nèi)，從而起到信號(hào)放大的作用[19～21]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

二氧化硅納米顆粒形貌及粒徑采用日本JEM100CXII 型透射電鏡進(jìn)行測定；官能團(tuán)表征采用美國Nicolet 5700 型紅外光譜儀測量；細(xì)胞成像采用Nikon ECLIPSE TE2000 U 熒光倒置顯微鏡。

曲拉通（Triton X 100）、環(huán)己烷、正己醇、氨水、正硅酸四乙酯（TEOS）、羧基乙基硅烷三醇鈉鹽（CEOS）、＼[羥基 （聚乙二醇） 丙基] 三乙氧基硅烷（HPEOPES）、1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo NHS）、親和素（Avidin）、2 （N嗎啡啉乙磺酸（MES）、釕聯(lián)吡啶 （Rubpy），均購于Sigma公司；人肝癌LM 9細(xì)胞株由武漢大學(xué)中南醫(yī)院提供；人肝癌Huh 7 細(xì)胞株購于中國典型物培養(yǎng)中心；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均采用三次蒸餾水。

2.2 表面官能團(tuán)修飾的二氧化硅熒光納米顆粒合成

包裹染料的二氧化硅納米顆粒合成采用油包水（W/O）的反相微乳法[22]。首先取1.77 mL Triton X 100、7.5 mL環(huán)己烷、1.6 mL 正己醇和400 μL水，于室溫下磁力攪拌10 min后形成微乳體系；在此體系中加入80 μL 濃度為 0.1mol/L釕聯(lián)吡啶溶液，攪拌5 min，加入100 μL TEOS 攪拌30 min后再加入60 μL 氨水在室溫下攪拌用于引發(fā)形成核殼結(jié)構(gòu)。24 h 后，向體系中加入50 μL TEOS和50 μL CEOS，在室溫下進(jìn)一步攪拌12 h 可以得到羧基修飾的二氧化硅納米顆粒（RSiNPs COOH）；而PEG修飾的二氧化硅納米顆粒（RSiNPs PEG）則加入100 μL TEOS和100 μL HPEOPES。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，用丙酮破乳，最后分別用乙醇和水離心洗滌3次，將得到的納米顆粒經(jīng)真空冷凍干燥后備用。

2.3 親和素修飾的二氧化硅熒光納米探針的制備

2.3.1 探針A 的制備 將1 mg EDC、2.5 mg Sulfo NHS和1 mg 羧基修飾的納米顆粒一起加入到 1 mL 0.1 mol/L MES 緩沖液中， 并在室溫下活化反應(yīng)15 min。整個(gè)溶液經(jīng)離心洗滌后重新分散在1 mL PBS緩沖液（pH 7.4）中，立即加入50 μL 1 g/L 親和素后， 在室溫下置于搖床反應(yīng)2 h，隨后向溶液中加入100 μL 含有2% 牛血清蛋白的PBS緩沖液封閉1 h。待反應(yīng)完成后，經(jīng)離心洗滌后親和素修飾的納米顆粒被重新分散在PBS緩沖液（pH 7.4）中，并在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 探針B 的制備

將1 mg PEG修飾的納米顆粒分散到1 mL 2 mol/L Na2CO3緩沖液中，充分混勻后，立即加入1 mL 溴化氰的乙腈溶液（0.8 g/mL），室溫下攪拌15 min，經(jīng)活化的納米顆粒用冰水和PBS緩沖液（pH 7.4）各洗2次后，分散到1mL PBS緩沖液，立即向溶液中加入50 μL 1 mg/mL 親和素，置于4 ℃ 反應(yīng)24 h， 待反應(yīng)完成后加入100 μL 含有2% 牛血清蛋白的PBS緩沖液，在4 ℃過夜。經(jīng)過反復(fù)離心洗滌后親和素修飾的納米顆粒被重新分散在PBS緩沖液（pH 7.4）中，并在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?

2.4 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)與識(shí)別

2.4.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞LM 9、Huh 7用DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 mg/L青霉素）吹散，于5% CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部90%時(shí)，用1 mL 1%胰蛋白酶消化液處理細(xì)胞1～3 min，待細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，加入9 mL DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞吹勻后將其平均分裝在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中。取一定體積的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到50%～80%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)與傳代時(shí)所用器皿及試劑均進(jìn)行過高壓滅菌或過濾除菌。

2.4.2 肝癌細(xì)胞LM 9的識(shí)別

分別取100 μL探針A和探針B到已固定好LM 9細(xì)胞的培養(yǎng)板中，并在每孔補(bǔ)加100 μL PBS緩沖液（pH 7.4）置于37 ℃ 下孵育2 h，孵育完成后，再用PBS緩沖液洗滌3次， 以除去沒有反應(yīng)的探針。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組操作的區(qū)別在于前者不加兔抗CEA抗體。

2.4.3 肝癌細(xì)胞Huh 7的識(shí)別

取100 μL探針B到已固定好Huh 7細(xì)胞的培養(yǎng)板中，并在每孔補(bǔ)加100 μL PBS緩沖液（pH 7.4）置于37 ℃ 下孵育2 h，孵育完成后，再用PBS緩沖液洗滌3次， 以除去沒有反應(yīng)的探針。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組操作的區(qū)別在于前者不加兔抗CEA抗體。

3 結(jié)果與討論

3.1 二氧化硅熒光納米顆粒大小形貌表征

采用透射電鏡對(duì)合成的羧基和PEG修飾的二氧化硅的進(jìn)行了表征，從圖1可見，羧基和PEG修飾納米顆粒都有很均一的尺寸，粒徑約為60 nm。此外，通過高分辨電鏡可以明顯地觀察到包裹熒光染料二氧化硅納米顆粒的核殼結(jié)構(gòu)。

3.2 熒光光譜和紅外表征

實(shí)驗(yàn)表明，熒光染料RuBpy溶液的熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長為610 nm，本研究制備的兩種包裹RuBpy的熒光納米顆粒RSiNPs COOH和RSiNPs PEG均發(fā)射明亮的紅色熒光，其最大發(fā)射波長分別為609和610 nm。因此，二氧化硅基本上不影響RuBpy的熒光發(fā)射光譜。

通過紅外光譜對(duì)二氧化硅球表面的官能團(tuán)進(jìn)行了證實(shí)，結(jié)果如圖2所示。 特征峰歸屬如下： 3400 cm

Symbolm@@ 1左右的為OH的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1100 cm

Symbolm@@ 1附近的吸收峰為亞甲基的伸縮振動(dòng)，證明二氧化硅復(fù)合納米顆粒表面已分別成功修飾上了羧基和PEG。

3.3 肝癌細(xì)胞識(shí)別和成像

采用間接免疫熒光法對(duì)肝癌細(xì)胞表面的CEA進(jìn)行標(biāo)記，并通過抗原 抗體、生物素 親和素之間的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的免疫熒光標(biāo)記成像，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的識(shí)別。分別使用RSiNPs COOH、RSiNPs PEG作為信號(hào)指示探針對(duì)肝癌細(xì)胞LM 9表面的CEA進(jìn)行標(biāo)記。

為了考察納米探針是通過抗原抗體特異性靶向模式與肝癌細(xì)胞結(jié)合，還是通過非特異性吸附于肝癌細(xì)胞表面，設(shè)置了對(duì)照組實(shí)驗(yàn)：以PBS代替兔抗CEA抗體IgG。探針A和探針B對(duì)LM 9中CEA的標(biāo)記結(jié)果如圖3所示。

在探針A對(duì)細(xì)胞的識(shí)別實(shí)驗(yàn)組中，在熒光圖像中可觀察到部分肝癌細(xì)胞LM 9表面發(fā)出了紅色熒光，而在明場和熒光的疊加圖像中，部分細(xì)胞并未發(fā)出紅色的熒光，這可能是因?yàn)樘结楢與細(xì)胞之間存在空間位阻，僅有部分細(xì)胞被標(biāo)記。而在探針B的識(shí)別實(shí)驗(yàn)組中，熒光顯微鏡下可觀察到絕大部分肝癌細(xì)胞LM 9表面發(fā)出了強(qiáng)烈的紅色熒光，在明場和熒光場的疊加圖中絕大部分的細(xì)胞均發(fā)出了紅色熒光，說明了肝癌細(xì)胞LM 9表面結(jié)合了大量的探針B。在相應(yīng)的對(duì)照組中，肝癌細(xì)胞幾乎沒有熒光信號(hào)，說明探針B與肝癌細(xì)胞之間無明顯的非特異性吸附。這表明探針B是以抗體 抗原結(jié)合模式結(jié)合到肝癌細(xì)胞表面的，同時(shí)也說明在avidin與PRSiNPs之間的PEG分子，極大地提高了Avidin分子的自由度和活性[23，24]。

上述方法具有普適性，基于相同模式，在理論上可以用于多數(shù)癌細(xì)胞的標(biāo)記。為了進(jìn)一步證明這種間接免疫熒光法的普適性， 使用探針B對(duì)另一種肝癌細(xì)胞Huh 7的表面CEA進(jìn)行了標(biāo)記，結(jié)果如圖4所示。

在熒光顯微鏡下可觀察到實(shí)驗(yàn)組的肝癌細(xì)胞Huh 7表面發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，說明肝癌細(xì)胞Huh 7表面結(jié)合了大量探針B。同時(shí)，在對(duì)照組中，肝癌細(xì)胞上幾乎未觀察到熒光信號(hào)，說明探針B與肝癌細(xì)胞之間無明顯非特異性吸附。明場和熒光的疊加圖像清楚地表明該探針對(duì)癌細(xì)胞具有很高的識(shí)別效率。因此，基于探針B的間接免疫熒光法具有較好的普適性。

4 結(jié) 論

制備了羧基和PEG修飾的包裹釕聯(lián)吡啶二氧化硅熒光納米顆粒，設(shè)計(jì)了兩種用親和素修飾的二氧化硅熒光納米探針， 并對(duì)肝癌LM 9細(xì)胞標(biāo)記，結(jié)果表明：表面修飾PEG分子的納米探針能有效地識(shí)別癌細(xì)胞表面靶蛋白，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的識(shí)別和檢測。采用此探針成功地對(duì)肝癌Huh 7細(xì)胞進(jìn)行了識(shí)別，并驗(yàn)證了該方法的普適性。

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