范巧寧，趙 珮，高曉梅，段玉峰

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槐米 產(chǎn)自山東省臨沂市費(fèi)縣。

1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·) 分析純，美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品;三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚(焦性沒(méi)食子酸)、三氯化鐵(FeCl3)、六氰合鐵化鉀(［K3Fe(CN)6］)、三氯乙酸(TCA)、苯酚、濃硫酸、乙醇(95%)、抗壞血酸(VC)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、FeCl3、CuSO4.5H2O、NaOH、NaOOC(CHOH)2COOK·4H2O、CCl4、異戊醇 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AL 204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海滬西分析儀器有限公司;722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;KQ 3200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司;TU 1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-8B型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;HHW-21CU-600型電熱恒溫水槽 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;800B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康技術(shù)公司;SHA-e型恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槐米多糖提取工藝流程 原料處理:槐米烘干(60℃)→粉碎→過(guò)篩(60目)→脫脂(80%乙醇)

提取方法:超聲提取→抽濾→濃縮→醇沉(過(guò)夜)→離心(3000r/min，10min)得沉淀→溶解、脫蛋白(sevag法)→透析→冷凍干燥。

熱水浸提:取處理后的干槐米粉5g，置于錐形瓶中，按文獻(xiàn)［8］得到的最佳條件下提取，之后按超聲波提取工藝中的步驟進(jìn)行處理。

1.2.2 提取分離 參考文獻(xiàn)［9］的方法。液料比30∶1(v/m)，提取時(shí)間 42.60min，提取溫度 65.78℃。由于以往文獻(xiàn)沒(méi)有介紹超聲功率的影響，本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)法，取5g搓碎槐米，按照上述條件進(jìn)行超聲波提取醇沉法提取多糖，超聲功率分別為160、240、320、400W，三次平行實(shí)驗(yàn)，苯酚硫酸法［19］測(cè)多糖含量，考查超聲功率對(duì)槐米多糖得率的影響情況。

1.2.3 多糖含量測(cè)定及得率計(jì)算 多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法［10］。精確稱(chēng)取粗多糖10.0mg溶解，定容至100mL容量瓶中，吸取該溶液1.0mL于試管中，依次加入5%苯酚溶液1.0、5.0mL濃硫酸，靜置30min，在490nm條件下測(cè)其吸光度值。重復(fù)三次，求其平均值。得率計(jì)算公式為:

式中，C:溶液中粗多糖濃度;V:溶液總體積;M:脫脂后槐米質(zhì)量。

1.2.4 定性測(cè)定

1.2.4.1 紫外光譜分析 蛋白質(zhì)、多肽、核酸等物質(zhì)在260～280nm處有明顯吸收峰，通過(guò)紫外掃描鑒別多糖經(jīng)過(guò)四次sevag法脫蛋白前后溶液中是否含有蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)。

1.2.4.2 酚類(lèi)物質(zhì)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［11］的方法。

沈老七是河口最富有的莊園主，這垸里肥得流油的河沙地大多是他置下的。沈家大院有三進(jìn)四十八大間，是這方圓百里最氣派的莊園。那時(shí)時(shí)局很亂，常常有兵隊(duì)路過(guò)河口，他家就成了不折不扣的兵站。雖然折了些錢(qián)財(cái)?shù)蚣乙策€算平安無(wú)事。不過(guò)，那年日本人打過(guò)長(zhǎng)江駐進(jìn)沈家大院以后卻引來(lái)了血光之災(zāi)。

1.2.4.3 還原性檢測(cè) 將干燥后的槐米粗多糖溶解于適量的蒸餾水中，得粗多糖溶液。取該溶液2mL，加入新配制的斐林試劑2mL，煮沸2min，觀察反應(yīng)中顏色的變化。

取粗多糖溶液2mL，加入新配制的雙縮脲2mL(先加A試劑2mL，再加B試劑3～4滴)，在沸水浴中反應(yīng)2min，觀察反應(yīng)中顏色的變化［11］。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定 總還原能力測(cè)定:采用普魯士藍(lán)法［12］，于1mL不同質(zhì)量濃度的粗多糖(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)的樣品溶液分別依次加入為2.5mL的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和2.5mL的鐵氰化鉀溶液(1%)，混勻，50℃ 水浴20min后，再加入2.5mL、10% 的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液2.5mL，依次加2.5mL蒸餾水和0.1%FeCl3溶液1mL，在700nm處測(cè)定吸光度值，吸光度越高，還原能力越強(qiáng)，三次平行，求其平均值，以VC和BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。

(DPPH·)清除能力的測(cè)定 于0.5mL不同質(zhì)量濃度的粗多糖(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)的樣品溶液依次分別加入0.5mL蒸餾水、2mL 2×10-4mol/L DPPH溶液(用95%乙醇配制)，充分搖勻，室溫避光反應(yīng)30min后在517nm處測(cè)定吸光度。以95%乙醇代替樣品液作為空白組;以95%乙醇代替DPPH·溶液作為對(duì)照組，并以VC和BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算清除率:

式中，A1:加入樣品后的吸光值;A2:對(duì)照組吸光值;A0:空白組吸光值。

羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定 采用芬頓(Fenton)體系鄰二氮菲-Fe2+氧化法進(jìn)行測(cè)定［13］于10mL試管中依次加入2mL FeS04溶液(6mmol/L)、2mL 不同質(zhì)量濃度的粗多糖(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL)的樣品溶液、2mL H2O2(6mmol/L)溶液，充分搖勻，靜置10min。再加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL，充分搖勻，靜置30min，在510nm處測(cè)定其吸光度值。陰性對(duì)照不加樣，以蒸餾水代替。以VC、BHT作陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理試樣均做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

計(jì)算公式:

式中，A1:加入樣品后的吸光值;A2:樣品本底吸光值;A0:空白吸光值。

式中:A0-鄰苯三酚的自氧化速率;A-加入多糖樣品后鄰苯三酚的自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取分離條件選擇

超聲功率對(duì)多糖得率的影響結(jié)果如下:

由圖1知，超聲功率的大小對(duì)槐米多糖得率影響不大，超聲功率為320W時(shí)，得率最大，得率為1.2%，每個(gè)水平進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)(p=0.009＜0.01)，但超聲功率過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多糖降解，因此，選擇320W為較理想。

圖1 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，線性回歸方程為:Y=0.0922X+0.0171，相關(guān)系數(shù) R2=0.9998。

圖2 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of polysaccharide

2.3 不同提取方法得到的槐米粗多糖的含量

超聲提取:最佳工藝為液料比30.00mL·g-1，提取時(shí)間42.60min，提取溫度65.78℃，超聲功率320W，該條件下槐米多糖得率為1.52%;熱水浸提:最佳工藝為提取溫度90℃，料水質(zhì)量比15mL·g-1，提取時(shí)間90min，所得槐米粗多糖的得率為1.25%，超聲波提取法比熱水浸提法得率提高了21.6%。由于經(jīng)過(guò)了四次脫蛋白，多糖有所損失，因此，測(cè)得的槐米多糖得率比以前文獻(xiàn)報(bào)道的低一些。

2.4 紫外光譜掃描結(jié)果

圖3所示:在波長(zhǎng)260nm無(wú)吸收峰，280nm有吸收峰。說(shuō)明多糖中不含核酸，但含有蛋白質(zhì)(圖3a);四次脫蛋白后，280nm吸收峰消失，說(shuō)明已將蛋白清除(圖3b)。

圖3 紫外光譜圖Fig.3 The ultraviolet spectrogram

2.5 定性反應(yīng)結(jié)果

由表1知:槐米多糖經(jīng)過(guò)sevag脫蛋白后，定性反應(yīng)均為陰性，即槐米多糖中無(wú)可溶性還原性多糖、游離的蛋白質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)。

表1 定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The qualitative reaction

2.6 抗氧化活性的測(cè)定

2.6.1 總還原能力 抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在直接的聯(lián)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。通常采用鐵氰化鉀氧化樣品來(lái)表征還原力，體系中Fe3+在抗氧化劑的促進(jìn)下變成 Fe2+，形成的Fe2+在700nm處有吸收峰檢出。最終測(cè)定的吸光值越大，還原力越強(qiáng)［14］。由圖4可知，超聲提取槐米多糖與水提多糖的還原力與粗多糖質(zhì)量濃度成正相關(guān)，與VC還原力相差較大，說(shuō)明槐米粗多糖的還原力較弱，明顯低于 VC和BHT的還原力。另外，超聲提取所得槐米多糖的還原力略強(qiáng)于水提多糖，當(dāng)質(zhì)量濃度高于1mg/mL時(shí)，超聲提取多糖增加幅度較水提多糖高一些。dps軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明:超聲提取槐米多糖與水提多糖的還原力相比較p=0.0034＜0.01。各個(gè)水平進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，Duncan新復(fù)極差法分析:BHT的還原力(p=0.009)達(dá)到極顯著水平，VC、超聲提取槐米多糖、水提多糖的還原力(p＜0.05)為顯著。

圖4 槐米多糖的總還原能力Fig.4 Reducing power of Flos Sophora polysaccharides

2.6.2 對(duì)DPPH自由基的清除作用 DPPH法是評(píng)價(jià)抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測(cè)定物質(zhì)的抗氧化活性［15］。圖5所示，超聲提取所得槐米多糖清除DPPH自由基的能力優(yōu)于水提槐米多糖，但兩者的清除能力都高于BHT，低于VC。隨著質(zhì)量濃度成倍增加，VC、超聲提取多糖對(duì)DPPH·清除作用趨于平緩，相比之下，超聲提取多糖的清除作用變化較大。在質(zhì)量濃度低于0.25mg/mL時(shí)，超聲提取多糖與水提多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力接近，而當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.25mg/mL時(shí)，與水提多糖相比，超聲提取多糖上升較快。但在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除能力低于60%。dps軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明:超聲提取槐米多糖與水提多糖清除DPPH自由基的能力相比較p=0.0432＜0.05。各個(gè)水平進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，Duncan新復(fù)極差法分析知:BHT、水提多糖、超聲提取槐米多糖、VC對(duì)DPPH·清除能力(0.01≤p＜0.05)均在顯著水平范圍。

圖5 槐米粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect of crude polysaccharides from Flos Sophora on DPPH radicals

圖6 槐米粗多糖對(duì)羥基自由基的清除效果Fig.6 Scavenging activity of crude polysaccharides from Flos Sophora on hydroxyl radical

2.6.3 對(duì)·OH的清除作用 多糖分子上具有還原性的半縮醛羥基，可將自由基還原，達(dá)到阻止自由基連鎖反應(yīng)的目的，圖6所示，槐米粗多糖的清除·OH的能力與其質(zhì)量濃度正相關(guān)。在濃度達(dá)到2mg/mL時(shí)，VC對(duì)·OH的清除可達(dá)到98.4%，說(shuō)明超聲提取粗多糖和水提多糖對(duì)·OH的清除作用都與多糖濃度有著較大的依賴(lài)關(guān)系，隨著粗多糖濃度的增加，·OH清除效果也隨之增加，超聲提取粗多糖比水提多糖的增加幅度大，但當(dāng)濃度達(dá)到2mg/mL時(shí)，兩者的清除能力相當(dāng)，清除率達(dá)到75.4%。說(shuō)明高濃度的槐米粗多糖對(duì)·OH也有著明顯的清除作用，能夠有效的抗氧化。dps軟件分析表明:超聲提取槐米多糖與水提多糖清除·OH的能力相比較p=0.0392＜0.05。各個(gè)水平進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:Duncan新復(fù)極差法分析p值大小為:BHT(p＜0.001)＜水提多糖(p＜0.01)＜超聲提取槐米多糖(p＜0.01)＜VC(p＜0.01)，即BHT對(duì)·OH的清除能力呈極高顯著，其余三個(gè)處理均達(dá)到了極顯著水平。

在相同質(zhì)量濃度下，超聲提取所得槐米多糖的抗氧化活性?xún)?yōu)于水提槐米多糖，其原因可能有:超聲提取法大大縮短了提取時(shí)間，而且提取過(guò)程中無(wú)化學(xué)反應(yīng)，使得在短時(shí)間內(nèi)多糖生物活性沒(méi)有損失［18］;兩種多糖的抗氧化活性的差異還可能與不同提取方式所導(dǎo)致多糖分子的單糖組成及糖苷鍵型不同有關(guān)［19］。

圖7 槐米粗多糖對(duì)·的清除效果Fig.7 Scavenging effect of crude polysaccharides from Flos Sophora on superoxide anion radicals

2.6.5 半數(shù)清除質(zhì)量濃度(EC50)測(cè)定結(jié)果 作為評(píng)價(jià)抗氧化能力的指標(biāo)EC50，指清除率為50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度。所需質(zhì)量濃度越低，表明半清除率越高，清除效果越好。由表2知，對(duì)自由基清除的EC50值排序?yàn)?BHT＞水提多糖＞超聲提取多糖＞VC，這說(shuō)明在相同質(zhì)量濃度下，超聲提取所得槐米多糖的自由基清除能力要明顯高于水提多糖。因此，超聲提取所得槐米多糖具有較好的抗氧化活性。

表2 多糖和 VC的EC50值Table 2 The value of EC50on polysaccharides and VC

3 結(jié)論

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