魏小玲，馮斐斐，何其棟，馮悅靜，王 威，吳擁軍

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 鄭州450001 2)鄭州市第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州450061 3)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室鄭州450001

#通訊作者，男，1968年1月生，博士，教授，研究方向:生化與分子毒理，E-mail:wuyongjun@zzu.edu.cn

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率與病死率均居首位的惡性腫瘤，受現(xiàn)有檢測(cè)手段限制，絕大多數(shù)患者首診為肺癌時(shí)已是晚期，5 a 生存率僅為15%，而早期診斷可以改變這一現(xiàn)狀［1-2］。DNA 甲基化異常是惡性腫瘤中常見現(xiàn)象，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］，其基本過程是在DNA 甲基化酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化下，以S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)為甲基供體轉(zhuǎn)移甲基到胞嘧啶環(huán)的第5 位碳原子(或腺嘌呤環(huán)的N6 位)上，生成5-甲基胞嘧啶(或6-甲基腺嘌呤)，得到甲基化的DNA［4-5］。研究［6-7］證實(shí)，DNMTs 表達(dá)及活性異常是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞某些癌基因異常高甲基化的原因，因此是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。由于DNA 甲基化出現(xiàn)在幾乎所有腫瘤中，并且發(fā)生在癌前病變和癌變?cè)缙?，因此是腫瘤早期診斷的理想標(biāo)志［8］，改變DNA 甲基化狀態(tài)，可能為癌癥的預(yù)防和治療提供新的策略。作者采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA 法)測(cè)定血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 的表達(dá)情況，探討DNMTs 應(yīng)用于肺癌研究的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 肺癌患者(肺癌組)選自2012年9月至2013年3月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科及河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科、均經(jīng)病理或針吸細(xì)胞學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肺癌的病例。肺部良性疾病患者(對(duì)照組)選自同期鄭州市第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科、被證實(shí)未合并有肺或其他器官腫瘤的病例。所有入選對(duì)象對(duì)該研究均知情并同意，由專業(yè)的調(diào)查員和醫(yī)生采集研究對(duì)象的血標(biāo)本。

1.2 研究方法 采集研究對(duì)象空腹8 h 靜脈血5 mL，于非抗凝干燥無菌真空管內(nèi)靜置1 h，2 000 r/min離心5 min，分離血清并分裝，－80℃存儲(chǔ)備檢。ELISA 法檢測(cè)2組血清DNMTs 水平，ELISA 檢測(cè)試劑盒購自美國R＆D 公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Excel 2003 建立數(shù)據(jù)庫，Curve Exert 1.3 進(jìn)行ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，直線回歸分析的線性相關(guān)系數(shù)r 不低于0.95，采用SPSS 12.0 進(jìn)行分析，連續(xù)性變量正態(tài)分布時(shí)應(yīng)用ˉx±s、非正態(tài)分布時(shí)采用中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，兩組間一般情況及血清DNMTs 表達(dá)水平的比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或者秩和檢驗(yàn);定性資料組間比較用χ2檢驗(yàn)。按3 種DNA 甲基化酶水平的百分位數(shù)25%、50%、75%為分界點(diǎn)分別將肺癌組和對(duì)照組分為4 層，探討DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表達(dá)水平與肺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組基本情況的比較 肺癌組共136例，其中男101例，女35例，年齡(60.75±9.55)歲;吸煙者76例，不吸煙者60例;鱗癌56例，腺癌44例，小細(xì)胞肺癌32例，其他4例;臨床Ⅰ+Ⅱ期共80例，Ⅲ+Ⅳ期共56例。對(duì)照組共141例，其中男107例，女34例，年齡(36.85±18.87)歲;吸煙者41例，不吸煙者100例。兩組間性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.097，P =0.755)，年齡、吸煙史差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =13.145，χ= 181.36，P 均＜0.001)。

2.2 2組血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表達(dá)水平比較 見表1。

2.3 性別、年齡、吸煙史對(duì)血清DNMT1、DNMT3a和DNMT3b 的影響 見表2。

表1 2組血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表達(dá)水平比較 μg/L

表2 年齡、性別和吸煙史對(duì)3 種DNMTs 表達(dá)水平的影響 μg/L

2.4 肺癌組織學(xué)類型和臨床分期對(duì)血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 的影響 見表3。

表3 肺癌患者組織學(xué)類型和臨床分期對(duì)DNMTs 表達(dá)水平影響 μg/L

2.5 血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表達(dá)水平與肺癌的危險(xiǎn)性 見表4。由表4可知，隨著DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平增加，患肺癌的危險(xiǎn)性增加。

表4 血清DNMT1、DNMT3a和DNMT3b 表達(dá)水平與肺癌的危險(xiǎn)性

3 討論

DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要修飾方式之一，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的控制中具有重要的作用。DNMTs 是作用于DNA 甲基化過程的關(guān)鍵酶，在胚胎早期細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生中起重要作用［8-9］。哺乳動(dòng)物的DNMTs 因結(jié)構(gòu)和功能不同分為兩類:一類以DNMT1 為主，參與甲基化狀態(tài)的維持，與甲基化狀態(tài)的延伸有關(guān);另一類是從頭甲基化酶，包括DNMT3a、DNMT3b 等［10-11］。DNA 是最穩(wěn)定的生物大分子，可以輕易從體液及組織中分離，且DNA 甲基化在人類癌癥中較為常見，使得DNA 甲基化標(biāo)志物的檢測(cè)存在較大優(yōu)勢(shì)［12-13］。

該研究結(jié)果顯示，肺癌組患者血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平高于肺良性疾病組，經(jīng)性別、年齡和吸煙史的分層分析后發(fā)現(xiàn)DNMT3b 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。翟榮林等［14］研究發(fā)現(xiàn)DNMT3b mRNA 在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、Lovo 和Coca-2 中高度表達(dá)，且在不同結(jié)腸癌細(xì)胞系之間的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，指出DNMT3b 在建立和維持結(jié)腸癌細(xì)胞系DNA 甲基化模式中可能起更為重要的角色。有學(xué)者［15］探討DNMT3B 基因啟動(dòng)子-149C/T(C46359T)單核苷酸多態(tài)性與人群肺癌易感性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，攜帶有SNP(-149C/T)C→T 轉(zhuǎn)換的個(gè)體患肺癌的易感性并未明顯升高，提示DNMT3b 基因C46359T多態(tài)性可能不適合作為人群肺癌易感性的一個(gè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。該研究結(jié)果亦表明，隨著DNMT3b 表達(dá)水平增加，患肺癌的危險(xiǎn)性并未增加，與上述結(jié)果一致。該研究中組織學(xué)類型和臨床分期對(duì)3 種DNMTs 表達(dá)影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)［16-17］報(bào)道肺癌組織相對(duì)癌旁組織DNMT1 的高表達(dá)與肺癌的組織學(xué)類型和惡性表型有關(guān)不一致，可能是檢測(cè)標(biāo)本不同，需要進(jìn)一步研究血清標(biāo)本與組織標(biāo)本中DNMTs 表達(dá)的相關(guān)性，但DNMT1 在肺癌組織中高表達(dá)與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。有研究［18］提示DNMT1 mRNA 過表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示DNMT1 在不同腫瘤組織中表達(dá)模式可有不同。該研究中的年齡分層分析提示年齡對(duì)3 種DNMTs 在血清中的表達(dá)均無影響，但在＞40 歲組中肺癌組和對(duì)照組DNMT1、DNMT3a 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)［19］報(bào)道一致，但該研究中肺癌組和對(duì)照組年齡的差別可能會(huì)對(duì)年齡因素產(chǎn)生影響，有待于擴(kuò)大樣本量做更深研究。該研究結(jié)果對(duì)吸煙因素作分層分析，結(jié)果顯示兩組人群中吸煙均對(duì)3 種DNMTs 在血清中的表達(dá)無影響，與Lin 等［20］研究證實(shí)在吸煙的肺癌患者中，DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 蛋白表達(dá)明顯升高不一致，其原因也可能與標(biāo)本類型不一致有關(guān)，但與表4的結(jié)果提示DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平增加、患肺癌的危險(xiǎn)性增加較為一致。

綜上所述，DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 高表達(dá)可能是肺癌的危險(xiǎn)因素，檢測(cè)血清DNMTs 的變化可預(yù)測(cè)患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。

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