圖1 張文清教授

多糖是由多個(gè)單糖分子以苷鍵結(jié)合而成的高分子碳水化合物。多糖在自然界分布極廣，有的是構(gòu)成動(dòng)植物細(xì)胞壁的組成成分，有的是作為動(dòng)植物儲(chǔ)藏的養(yǎng)分，有的具有特殊的生物活性。自20 世紀(jì)50 年代以來(lái)，逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物活性和功能，已廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)、生物化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

華東理工大學(xué)上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天然產(chǎn)物研究團(tuán)隊(duì)在學(xué)術(shù)帶頭人張文清教授帶領(lǐng)下(圖1、2)，對(duì)多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)分析和活性研究建立了系統(tǒng)的方法，目前通過(guò)分離和生物技術(shù)開(kāi)發(fā)了多個(gè)多糖產(chǎn)品并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，特別是殼聚糖系列產(chǎn)品的研究，如植物活力劑寡糖素(圖3)，2003 年獲得上海市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)和上海市發(fā)明一等獎(jiǎng)。

圖2 團(tuán)隊(duì)研討

圖3 農(nóng)業(yè)生物制劑

殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過(guò)脫乙酰作用得到的，化學(xué)名稱(chēng)為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-2-脫氧-β-D 葡萄糖。這種天然高分子多糖由于其良好的生物相容性、可降解性、安全性和廣譜抗菌性等特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注。自Peter 于1984 年首次提出寡糖素能作為植物激發(fā)子以來(lái)，寡糖素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究開(kāi)發(fā)受到極大關(guān)注。由殼聚糖降解所得到的殼寡糖，作為植物抗病激發(fā)子具有調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、防病和抗病等方面的功能，能夠激發(fā)植物的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。殼寡糖作為植物抗病激發(fā)子，雖具有廣譜、持久的抗性，但與有機(jī)農(nóng)藥相比，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病效果存在滯后性、受環(huán)境因素影響較大和產(chǎn)品不穩(wěn)定等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受到一定程度的限制。

張文清課題組通過(guò)化學(xué)修飾制備殼寡糖季銨鹽，改變殼寡糖自身的電荷分布和強(qiáng)度，加強(qiáng)殼寡糖(配體)與受體之間相互作用，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植物抗毒素(Phytoalexin)，有效抵御病原菌的侵染(圖4)。以模式植物擬南芥為例，camalexin 是擬南芥產(chǎn)生的一種重要植保素，對(duì)擬南芥抵御腐生型病原真菌——灰葡萄孢菌侵染具重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖季銨鹽能迅速激活擬南芥分裂活化蛋白激酶MAPK3 和MAPK6，通過(guò)對(duì)camalexin 合成基因PAD3 的上調(diào)來(lái)調(diào)控camalexin 的合成，抑制灰葡萄孢菌孢子在擬南芥葉片上生長(zhǎng)。殼寡糖雖然也能激活MAPK3 和MPK6，但從速度和作用程度上來(lái)說(shuō)，要遠(yuǎn)低于殼寡糖季銨鹽所產(chǎn)生的效果。

殼寡糖季銨鹽能快速調(diào)節(jié)擬南芥氣孔的開(kāi)度并保持較長(zhǎng)時(shí)間，限制丁香假單胞菌的快速入侵。殼寡糖在此方面則“束手無(wú)策”。此研究為改善不同來(lái)源的寡糖素作為植物抗病激發(fā)子提供了一種新的策略。

模式植物擬南芥和水稻的殼寡糖受體AtCERK1 和OsCEBiP 直接結(jié)合殼寡糖，通過(guò)形成同源二聚體或異源二聚體并發(fā)生磷酸化作用，將殼寡糖信號(hào)由胞外傳遞到胞內(nèi)，激活植物的PTI。病原菌為了生存，其在與植物漫長(zhǎng)的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化出能夠?qū)TI 進(jìn)行抑制的效應(yīng)分子。病原真菌和病原細(xì)菌的抑制機(jī)制各不相同，細(xì)菌主要實(shí)行“攻擊消滅”，而病原真菌則采取“以守為攻”。例如細(xì)菌丁香假單孢菌的效應(yīng)分子AvrPtoB 能夠直接泛素化CERK1 來(lái)抑制植物的PTI 產(chǎn)生;真菌水稻稻瘟病能分泌具有LysM 功能域的效應(yīng)分子Slp1，Slp1 同時(shí)具有抑制植物分泌的幾丁質(zhì)酶活性及與CERK1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制植物PTI 的產(chǎn)生。

圖4 合成工藝圖

圖5 LysM-CERK1 嵌合受體載體的構(gòu)建

利用具有LysM 功能域的效應(yīng)蛋白能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合殼寡糖的特性，將Slp1 與擬南芥CERK1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建Slp1-CERK1 嵌合受體(圖5)。用殼寡糖處理表達(dá)嵌合受體的擬南芥cerk1 植株(CERK1 功能缺失突變體)，發(fā)現(xiàn)ROS 活性和殼寡糖相關(guān)基因(MAPK3、WRKY33、WRKY53)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均顯著上調(diào)，擬南芥中合成的camalexin 基因PAD3 也顯著上升，葉片中灰葡萄孢菌的菌絲生長(zhǎng)得到有效控制。此研究有助于更好地理解LysM 功能域與殼寡糖相互作用分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制，而且對(duì)合理利用具有LysM 功能域的效應(yīng)分子來(lái)提高植物的抗病性奠定了理論基礎(chǔ)。植物的誘導(dǎo)抗病性從激發(fā)子與受體識(shí)別開(kāi)始，到植物產(chǎn)生明顯的抗病防衛(wèi)反應(yīng)結(jié)束。在這一過(guò)程中，通過(guò)研究寡糖素和CERK1 受體的分子特性以及兩者之間的相互作用方式，探討殼寡糖類(lèi)抗病激活劑誘導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)節(jié)和防衛(wèi)基因的調(diào)控方式等。殼寡糖類(lèi)抗病激活劑優(yōu)良的誘導(dǎo)特性，有望使其成為新型的生物農(nóng)藥，相信隨著研究進(jìn)一步深入，殼寡糖類(lèi)抗病激活劑誘導(dǎo)的植物抗病的作用機(jī)制將逐步了解，將為其誘導(dǎo)植物抗病有效合理的應(yīng)用起了巨大的推動(dòng)作用。