馮志明，蔡俊，李旭紅，李其華，曹小妹

(1.湖南師范大學化學生物學及中藥分析省部共建教育部重點實驗室，長沙 410081；2.中南大學湘雅三醫(yī)院，長沙 410013)

化學發(fā)光免疫分析是利用酶催化的化學發(fā)光進行定量分析的光化學方法。相比傳統(tǒng)的放射免疫分析，化學發(fā)光免疫分析不需昂貴的實驗設(shè)備，無放射性污染，操作簡便。與酶聯(lián)免疫定性比色分析比較，化學發(fā)光免疫分析不僅靈敏度高，且能夠進行定量分析與檢測，應(yīng)用前景廣闊。

辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是常用的抗體標記酶，因其具有高轉(zhuǎn)換系數(shù)、適應(yīng)性廣和相對分子質(zhì)量小等特點而廣泛應(yīng)用于化學發(fā)光免疫分析［1］。魯米諾(luminol)是HRP催化氧化發(fā)光的常用底物。當不使用增強劑時，魯米諾體系的發(fā)光時間短、發(fā)光強度小、檢測靈敏度低。加入增強劑，可使發(fā)光強度提高，發(fā)光持續(xù)時間延長，提高了信噪比和靈敏度［2］。文獻報道的用于HRP酶促化學發(fā)光的增強劑雖然比較多，但價廉高效的增強劑仍值得探索［3］。

筆者選取價廉易得的商品酚酞為原料合成酚酞啉，探討了酚酞啉對HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光的增強特性以及用于HRP定量分析的可行性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

酸度計：pHS–25C型，上海精密科學儀器有限公司；

發(fā)光光度計：LKB–1250型，瑞典LKB公司；酚酞啉：參照文獻［4］合成，略有改進；

魯米諾和辣根過氧化物酶［RZ(A403／A275)～3.0］：美國Sigma-aldrich公司；

辣根過氧化物酶標記鼠抗人甲胎蛋白單克隆抗體包被IgG(Anti-AFP–HRP)：長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；

實驗所用其它化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

將適量的10 mmol／L酚酞、對碘酚或酚酞啉溶液(用pH 8.5 Britton-Robinson 緩沖液配制)、辣根過氧化物酶溶液(用pH 8.5 Britton-Robinson緩沖液稀釋至1×10–6g／L)和10 mmol／L魯米諾溶液(1.77 mg魯米諾溶于1 mL pH 8.5 Britton-Robinson緩沖液)充分混合后，加入30.0 mmol／L H2O2溶液到測定管中，在發(fā)光光度計中測定發(fā)光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 增強劑對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的增強作用

在HRP–Luminol–H2O2反 應(yīng) 體 系(1.0×10–7g／L HRP，3 mmol／L H2O2，1.5 mmol／L Luminol，pH 8.5)中，無增強劑時，發(fā)光強度低，且持續(xù)時間短。加入酚酞、對碘酚和酚酞啉(終濃度均為0.5 mmol／L)，均可顯著提高反應(yīng)體系的發(fā)光強度。對碘酚和酚酞啉不僅能顯著增強HRP酶催化的化學發(fā)光強度，而且在30～60 s發(fā)光強度達到峰值后衰減慢，持續(xù)發(fā)光可達20～30 min(見表1)。酚酞也可提高反應(yīng)體系的發(fā)光強度，但體系發(fā)光強度達到峰值后衰減較快。結(jié)果表明，酚酞啉和對碘酚對HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系的發(fā)光具有相似顯著的增強作用，克服了HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系瞬時發(fā)光、不易準確測量和發(fā)光強度低等缺點［5］。

表1 增強劑對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的增強效應(yīng)

關(guān)于HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系，一般認為HRP催化過氧化氫產(chǎn)生活性氧自由基，活性氧自由基再激發(fā)發(fā)光劑魯米諾形成激發(fā)態(tài)魯米諾自由基，魯米諾自由基再釋放光子返回基態(tài)［6–8］。實驗證明，在HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系中加入酚酞啉后，其最大發(fā)射波長仍為425 nm處，與文獻報道HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系發(fā)光光譜基本相同。說明酚酞啉沒有改變HRP酶促發(fā)光反應(yīng)的歷程，可能是酚酞啉更容易形成穩(wěn)定的自由基，起到能量傳遞中間體的作用，從而避免活性氧自由基之間的相互滅活，使酶促發(fā)光反應(yīng)溫和且持續(xù)。

HRP酶促反應(yīng)的發(fā)光強度隨時間變化而改變，啟動反應(yīng)后在30 s左右達到峰值，然后緩慢衰減。在實驗條件下，選擇啟動反應(yīng)后30 s時記錄發(fā)光強度較為合適，發(fā)光值較高且誤差小。

2.2 酸度對酚酞啉增強的HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光的影響

在HRP–Luminol–H2O2反 應(yīng) 體 系(1.0×10–7g／L HRP，1.5 mmol／L Luminol，0.5 mmol／L酚酞啉，3.0 mmol／LH2O2)中，通過改變緩沖液的pH值改變反應(yīng)體系的酸度，在pH 7.0～9.5范圍內(nèi)測定反應(yīng)啟動后30 s時的發(fā)光強度，結(jié)果見表2。

表2 酸度對酚酞啉增強的HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的作用

由表2可知，酸度對酚酞啉增強的HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光影響較大。相對發(fā)光強度在pH 8.5時達最大值，pH值低于8.5時衰減迅速，pH 8.5～9.5時緩慢衰減。pH值過低，不利于底物魯米諾自由基的生成；pH值過高，辣根過氧化物酶的活性受限。實驗選擇pH 8.5較為合適，靈敏度高。

2.3 酚酞啉的濃度對HRP–Luminol–H2O2化學發(fā)光的影響

在HRP–Luminol–H2O2反 應(yīng) 體 系(1.0×10–7g／L HRP，1.5 mmol／L Luminol，0.5 mmol／L酚酞啉，3.0 mmol／L H2O2，pH 8.5)中依次加入不同劑量的酚酞啉，記錄反應(yīng)啟動后30 s時的發(fā)光強度，結(jié)果見表3。

表3 酚酞啉的濃度對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的作用

由表3可知，酚酞啉濃度在0.5～1.0 mmol／L范圍內(nèi)有較好的增強效果。在HRP質(zhì)量濃度為1.0×10–7g／L時，加入0.5 mmol／L酚酞啉即可獲得理想的增強效果，酚酞啉濃度過高反而不利于反應(yīng)體系的發(fā)光。

2.4 標準曲線、精密度和檢出限

HRP采用0.1% BSA溶液應(yīng)用對數(shù)稀釋法，質(zhì)量濃度依次為1 600，800，400，200，100，50，25，10，5 pg／mL。在HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系(適量的HRP，1.5 mmol／L Luminol，0.5 mmol／L酚酞啉，3.0 mmol／L H2O2，pH 8.5)中，依次遞增辣根過氧化物酶含量，啟動反應(yīng)后30 s時記錄發(fā)光值(見圖1)。

圖1 辣根過氧化物酶濃度對HRP–Luminol–H2O2酶促發(fā)光的作用

在發(fā)光體系中加入酚酞啉，酶含量在5～800 pg／mL范圍內(nèi)(免疫分析常用檢測范圍)HRP濃度c與相對發(fā)光強度I顯示良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為lgI =1.15lgc+0.82，線性相關(guān)系數(shù)r=0.96。

對空白溶液進行10次平行測定，以測定結(jié)果的3倍標準偏差除以校準曲線斜率，求得方法的檢出限為1.25 pg／mL。

2.5 精密度試驗

取HRP樣品，按照實驗方法重復測定不同濃度的HRP樣品，進行精密度試驗，觀察批內(nèi)批間的變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗結(jié)果(n=10)

由表4可知，批內(nèi)相對標準偏差為2.8%～5.1%，批間的相對標準偏差為5.8%～8.1%，說明方法具有良好的精密度。

2.6 回收試驗

取HRP樣品，按照實驗方法測定，再分別加入不同體積的100 pg／mL HRP標準工作溶液，進行加標回收試驗，結(jié)果見表5。由表5可知，HRP加標回收率在93.5%～96.2%之間，說明方法具有較高的準確度。

表5 加標回收試驗結(jié)果

2.7 在HRP標記的AFP檢測中的應(yīng)用

HRP是常用的抗體標記酶，用于增強化學發(fā)光系統(tǒng)中具有樣品用量少、發(fā)光強度大、反應(yīng)時間短、無污染等優(yōu)點，在腫瘤標志物臨床檢測等免疫分析中應(yīng)用廣泛［9］。在發(fā)光反應(yīng)體系中選擇臨床檢驗應(yīng)用廣泛的辣根過氧化物酶標記鼠抗人甲胎蛋白單克隆抗體包被IgG代替HRP，觀察酚酞啉在其檢測中的初步應(yīng)用。

參照2.4中的測定方法，用Anti–AFP–HRP代替HRP，AFP質(zhì)量濃度依次為1 600，800，400，100，50，10 ng／mL。AFP含量在10～1 600 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為lgI=1.14lgc+0.78，線性相關(guān)系數(shù)r=0.98。由于AFP上標記的HRP相對較少，因此其線性范圍略寬于純的HRP。

3 結(jié)語

在HRP–Luminol–H2O2反應(yīng)體系中，增強劑酚酞啉的使用從其穩(wěn)定性及增強發(fā)光作用等都顯示出良好的特性，方法具有良好的精密度和準確度。與其它酚類有機增強劑［10–12］不同，酚酞啉合成與純化簡便，價廉高效，使用簡便，可以用于HRP及其標記物的化學發(fā)光定量分析。

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