王東升，辛 紅，邢世巖，李際紅，劉曉靜，吳岐奎

(山東農業(yè)大學林學院，山東泰安271018)

紫椴(Tilia amurensis Ruprecht)是椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tilia L.)高大落葉喬木樹種，用途廣泛，經(jīng)濟價值高，為國家二級保護植物［1］.由于對紫椴大規(guī)模采伐及其繁育困難，其數(shù)量逐年下降，許多優(yōu)良種質資源消失，導致紫椴資源遺傳多樣性不斷下降，遺傳基礎變得相對狹窄.目前對紫椴的研究主要集中在育種造林［2］、生態(tài)學［3］、木材結構［4］、優(yōu)良無性系選擇［5］等方面，在分子水平上的研究還不多.穆立薔等［6］通過ISSR技術對紫椴6個種群125個個體進行多樣性檢測，結果表明總的多樣性為93.85%，其具有較高的遺傳多樣性.劉贏男［7］通過ISSR分子標記技術對紫椴6個種群90個個體進行多樣性檢測，發(fā)現(xiàn)供試材料也具有較高的遺傳多樣性.林木基因資源是林木育種及林業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質基礎，通過對紫椴進行遺傳多樣性分析，構建聚類樹，以了解其系統(tǒng)發(fā)育，明確各種質資源間的親緣關系，最大效率進行種質資源的收集保存.AFLP方法多樣性高、重復性好［8］，因此，本研究采用AFLP分子標記技術對山東省5個地區(qū)收集的紫椴進行遺傳多樣性和親緣關系分析，以期為紫椴種質資源的評價、早期選育、保存與保護提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年5月上旬采集泰山后石塢(編號1－20)、嶗山北九水(編號21－25)、魯山雨林(編號26－30)、艾山南官山(編號31－42)、昆崳山環(huán)山路(編號43－62)的野生紫椴的正常生長、無病斑嫩葉，作為供試材料，共62份.每份材料單株采集，單株間相距10 m以上.用裝有變色硅膠的自封袋加以封存，封存過程中翻動2－3次，以保證葉片在12 h內達到完全干燥，用于DNA的提取.

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA制備 稱取紫椴完全干燥葉片約50 mg，參照洪丕征［9］的CTAB法提取DNA.

1.2.2 AFLP體系的建立 酶切采用雙酶切(PstⅠ和MseⅠ)，與連接同時進行，加入DNA模板200 ng、1 μL Adapter(10 mmol·L－1.PstⅠ接頭:5'＞ CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA ＜ 3'，5'＞ TGT ACG CAG TCT AC ＜3'.MseⅠ接頭:5'＞ GAC GAT GAG TCC TGA G ＜3'，5'＞ TAC TCA GGA CTC AT ＜3')、2 μL PstⅠ/MseⅠ(5 U·μL－1)、1 μL T4 Ligase(5 U·μL－1)等構建20 μL 反應體系.將此體系在37 ℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃下過夜.

以2 μL 酶切連接后的 DNA 產(chǎn)物為模板，加入 1 μL 預擴引物(10 μmol·L－1，PstⅠ 5'＞ GAC TGC GTA CAT GCA G ＜3'，MseⅠ 5'＞GAT GAG TCC TGA GTA A C ＜3')、0.5 μL Taq 酶(2 U·μL－1)等，構建25 μL預擴增體系.PCR擴增程序為:在94℃預變性2 min，隨后經(jīng)過94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸80 s，持續(xù)30個循環(huán)，之后72℃延伸5 min.

預擴產(chǎn)物稀釋20倍后作為選擴模板，加入篩選出的10 μmol·L－1的PstⅠ引物和MseⅠ引物各1 μL，0.5 μL的Taq酶(2 U·μL－1)構建25 μL的選擴增體系.按以下列程序進行PCR擴增:94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，進行第一輪擴增，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，共擴增12輪;接著進行94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，擴增23輪;然后72℃延伸5 min;最后將選擴增產(chǎn)物進行4%聚丙烯酰胺電泳，得到電泳圖.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 電泳圖經(jīng)ABI 377 PRISM 377 sequencer測序儀檢測片段大小，采用GENESCAN軟件進行分析，擴增后清晰可辨的條帶記為“1”，無帶的記為“0”，構建“01”矩陣，以供下一步分析.利用POPGENE version 1.31軟件計算多態(tài)帶比例(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、觀測的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's基因多樣性(H)、Shannon's信息指數(shù)(I).采用NTSYSpc version 2.10e軟件，得到相似系數(shù)SC矩陣.采用Dice系數(shù)非加權算術平均法(UPGMA)進行紫椴的聚類分析.

2 結果與分析

2.1 紫椴的AFLP分析

對9對多態(tài)性較好的引物進行擴增(圖1)，共獲得1374個條帶，其中1370條為多態(tài)帶，平均多態(tài)帶比率為99.70%(表1)，平均每對引物產(chǎn)生152條多態(tài)帶.引物不同則擴增效率不同.產(chǎn)生多態(tài)帶數(shù)量最少的引物是P-GAA/M-CAA，共擴增出127條;產(chǎn)生多態(tài)帶最多的引物是P-GAC/M-CAG，達171條.不同引物的多態(tài)帶百分率為99.20%－100.00%，說明AFLP標記在所分析的紫椴資源中多態(tài)性較好，是檢測紫椴遺傳多樣性的一種有效技術.檢測出位點遺傳多樣性指標 Na、Ne、H 和 I分別為1.9969、1.3404、0.2132、0.3405，均較大，顯示紫椴遺傳多樣性較高，遺傳變異相對廣泛.

圖1P-GAT/M-CTA擴增的紫椴AFLP圖譜Fig.1 AFLP profiles for singal plants of T.amurensis by P-GAT/M-CTA

表1 62個紫椴單株AFLP引物的多態(tài)性Table 1 The strip polymorphism of 62 single plants of T.amurensis after AFLP selective amplification

2.2 紫椴的特異性條帶

62個紫椴單株中有51個單株擴增出182條特異性條帶，占多態(tài)帶總數(shù)的13.3%，其中缺失帶為6條.56號單株擴增的特異性條帶最多，達到12條，包括1條缺失帶;其次是51號單株，擴增出11條特異性條帶，56號和51號單株都來自昆崳山.通過特異性條帶可將82.3%的紫椴單株辨別出來，說明AFLP技術在種質鑒定方面具有巨大潛力.9對引物擴增出的特異性條帶數(shù)為11－24，其中P-GAT/M-CAA擴增出的特異性條帶最多，達到24條;其次是 P-GAC/M-CAC、P-GAC/M-CAG、P-GAC/M-CT、P-GAT/M-CTA，都擴增出了23條特異性條帶;擴增出特異性條帶最少的是P-GAA/M-CAA，僅有11條.擴增出的條帶數(shù)量表明不同引物組合通過特異性條帶鑒別種質有效性的高低.

2.3 紫椴的遺傳相似性及其聚類分析

采用NTSYSpc version 2.10e軟件檢測62個紫椴單株間的相似性，相似系數(shù)為0.3911－0.7953，平均值為0.5761.1號與2號的相似性系數(shù)最大，說明1號與2號的親緣關系最近，這可能與這兩者來源地相同有關，它們都來自泰山后石塢.來自泰山的12號與來自昆崳山的56號的相似性系數(shù)最小，說明這兩者間的相似性較低，親緣關系較遠，這可能與它們來源地相距較遠、生長條件差異性較大有關.

對62個紫椴單株進行UPGMA聚類，在相似性系數(shù)為0.60處，將其分成12組.第1組包括1、2、3、7、10、11、12、14、15、17、18、19、20、31 號，共 14 個單株，其中來自泰山的有 13 個單株，來自艾山的有 1 個單株;第2 組包括5、6、13、21、22、23、24、25、26、28、30、37 號，共 12 個單株，來自泰山的有 3 個單株，魯山的有3 個單株，艾山的有1 個單株，嶗山的有 5 個單株;第 3 組包括 32、33、34、35、36、38、39、40、41、42、43、44、46、47、49、50、51、52、53、55、58、59、61、62 號，共24 個單株，其中來自艾山的有 10 個單株，來自昆崳山的有14個單株;第4組包括4、9、16號，共3個單株，均來自泰山;第5－9組各包括1個單株，分別是來自泰山的8號、昆崳山的54號、昆崳山的60號、昆崳山的57號、魯山的27號;第10組包括來自魯山的29號和來自昆崳山的48號單株;第11、12組各包括1個單株，分別是來自昆崳山的45號單株和來自昆崳山的56號單株.通過聚類分析可知，來源相同的單株并沒有嚴格地聚成一組，說明親緣關系與來源沒有嚴格的一致關系.來自昆崳山的紫椴分散在7個組中，說明昆崳山的紫椴變異范圍較廣泛.

3 小結與討論

本研究通過9對AFLP引物組合獲得了千余條穩(wěn)定而有效的條帶，這充分驗證了AFLP標記方法的可靠性、穩(wěn)定性和高效性.此外，采用機器讀帶，避免了人工讀帶誤差大的缺點，精確性大大提高.一般認為，P值超過50%，則認為該物種具有較豐富的遺傳多樣性［10］.本研究檢測的紫椴遺傳多樣性達到99.70%，比劉贏男［7］和穆立薔等［6］通過ISSR技術檢測的結果都高，這可能與采用的方法不同有關.AFLP被認為是迄今為止最有效的分子標記［11］.另外，供試材料的來源、樣本的大小都會對遺傳多樣性造成一定影響.遺傳多樣性能夠反映一個物種對環(huán)境的適應能力、生存能力.有的學者認為，特有或瀕危物種具有較低的遺傳多樣性［12－13］.但更多的研究報道卻揭示，稀有或瀕危種并未表現(xiàn)出遺傳變異水平的下降，有些特有種甚至瀕危種也可能具有較高的遺傳多樣性［14－16］，本研究也證明了這一點.因此單憑遺傳多樣性不能夠準確而充分地反映種群的生存狀態(tài)，為進一步揭示遺傳多樣性與物種保護之間的關系，還需要將形態(tài)生理、生態(tài)學、分子水平的相關研究綜合起來進行分析.

圖2 62個紫椴單株基于AFLP分析的UPGMA聚類結果Fig.2 Dendrogram of UPGMA analysis of 62 signal plants of T.amurensis based on AFLP markers

51個單株擴增出了182條特異性條帶，占多態(tài)帶總數(shù)的13.3%，其中缺失帶為6條，可將82.3%的紫椴單株辨別出來.特異性條帶是某個單株的特有帶，是進行特殊性狀標記的基礎.因此，可利用特異性條帶進行種質資源的鑒定.這比依據(jù)表型性狀進行種質資源分類更加全面和精確，更能真實反映不同種質資源間的遺傳背景和遺傳差異.此外，通過比較條帶存在與否、條帶的數(shù)量可發(fā)現(xiàn)不同紫椴單株之間遺傳多樣性和親緣關系.差異帶數(shù)越多，單株間的遺傳相似性越低，遺傳多樣性越豐富，親緣關系越遠;反之，則相似性越大，親緣關系越近［17］.特異性條帶的存在還可能與種質資源對環(huán)境的適應力有一定聯(lián)系，可以作為基因資源保護的一個依據(jù).

聚類分析一定程度上可以反映種質資源的起源和分類［18］.62個單株相似系數(shù)為0.3911－0.7953，平均值為0.5761，在相似性系數(shù)為0.60處，可將所有單株分成12組，從個體的聚類圖上可以看出:來源相同的紫椴單株不能完全按照地域聚類.不同地區(qū)的紫椴在聚類圖中也沒有明顯界限，來源于昆崳山的種質分布于7個組中，表明供試昆崳山紫椴種質存在著較寬的遺傳基礎.這可能是紫椴的起源和親緣關系較為復雜所致，也可能是因為地區(qū)之間紫椴的廣泛交流導致了某些基因在不同地區(qū)種質間的滲入.

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