劉 洋， 杜 明， 張根義

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

復(fù)雜的自然界中經(jīng)常會有不同類型的真菌毒素共同存在，人們在生活中有可能同時接觸2種甚至2種以上的毒素，不同毒素共存時對機(jī)體的聯(lián)合毒性作用引起了人們的廣泛研究。M.J.Ruiz研究了白僵菌素（BEA）、嘔吐毒素（DON）和 T-2毒素在CHO-K1細(xì)胞中的聯(lián)合作用，其中BEA和T-2毒素為協(xié)同作用，DON與BEA、T-2均顯示為拮抗作用[1]；熊麗林求得微囊藻毒素和黃曲霉毒素及伏馬菌素的聯(lián)合作用類型為加和作用[2]。

黃曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，簡稱 AFB1）是目前已知的毒性較強(qiáng)的真菌毒素，它可以導(dǎo)致誘發(fā)性肝癌的產(chǎn)生。有關(guān)黃曲霉毒素在不同劑量下單獨作用于多種細(xì)胞的急慢性毒性已有很多報道，但關(guān)于黃曲霉毒素與其它毒素的聯(lián)合作用的毒性研究較少。雜色曲霉素（Sterigmatocystin，簡稱ST）由10多種真菌代謝產(chǎn)生，是一種含有呋喃環(huán)的氧雜蒽酮類化合物，已知被ST污染的食品包括大米、小麥、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等，而黃曲霉毒素AFB1也廣泛存在于各種谷物和飼料中，它們共存的可能性非常高。為此選取了黃曲霉毒素B1和雜色曲霉素進(jìn)行聯(lián)合毒性的研究。AFB1的主要靶器官是肝臟，同時ST在肝內(nèi)會轉(zhuǎn)化成1，2-環(huán)氧ST，該物質(zhì)會與DNA形成加合物，這極有可能是ST導(dǎo)致肝癌發(fā)生的機(jī)制[3]，因此肝臟是 AFB1和 ST共同的主要靶器官。

HepG2細(xì)胞來源于人肝胚細(xì)胞瘤，分化程度較高[4]，并且其所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實質(zhì)細(xì)胞具有同源性，其中肝細(xì)胞色素P450是主要參與體內(nèi)藥物代謝的酶系[5]，對許多內(nèi)源性、外源性化合物在體內(nèi)Ⅰ相生物轉(zhuǎn)化有重要作用，許多藥物通過P450酶的調(diào)控作用來影響其活性，因而選擇HepG2細(xì)胞為實驗對象，來研究AFB1和ST的聯(lián)合毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2人肝癌細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、無酚紅HBSS，Gibco公司提供；雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品（ST）、黃曲霉B1標(biāo) 準(zhǔn) 品 （AFB1）、SRB、TCA、H33258、Tris base、小 牛胸腺 DNA、DCFH-DA、DCF、羅丹明 123，Sigma公司提供；ATP檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)公司提供；Infinite 1000酶標(biāo)儀，Tecan公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

HepG2細(xì)胞用內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培育至對數(shù)生長期[6]。用DMSO溶解AFB1、ST制成母液，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋1 000倍至DMSO終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的儲備液。用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DMSO溶液的DMEM培養(yǎng)基將儲備液配制為所需濃度的工作液。

1.3 細(xì)胞毒性測定方法

1.3.1 SRB法測定AFB1、ST對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 調(diào)整對數(shù)期細(xì)胞密度為3×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入4℃預(yù)冷的三氯乙酸（TCA）溶液，4℃固定1 h，去離子水洗4～5次，風(fēng)干后每孔加入4 g/L SRB溶液，室溫下孵育30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乙酸洗4～5次，風(fēng)干后每孔加入10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），搖動混勻，震蕩5 min后在490 nm下測定吸光度A（下標(biāo)g、k、d分別表示給藥組、空白組、對照組）。計算不同時間、不同濃度的真菌毒素對HepG2細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率

Y=[1-（Ag-Ak）/（Ad-Ak）]×100%。

其中 AFB1染毒濃度為 0 （溶劑對照）、1、5、10、50、100 μmol/L，ST 染毒濃度為 0（溶劑對照）、0.1、1、5、10、14 μmol/L，溶劑對照組為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基，每個實驗組4個重復(fù)。

1.3.2 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞各部位損傷的檢測 設(shè)置染毒劑量時使大部分細(xì)胞處于染毒未致死的狀態(tài)，其中AFB1染毒濃度為0（溶劑對照）、0.5、1、5、10 μmol/L；ST 染毒濃度為 0 （溶劑對照）、0.5、2.5、5、7 μmol/L；聯(lián)合染毒組設(shè)置為 0（溶劑對照），AFB1（10 μmol/L）+ST（濃度設(shè)置與單獨染毒組相同），ST（5 μmol/L）+AFB1（濃度設(shè)置與單獨染毒組相同）；對照組為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基，每個實驗組4個重復(fù)[2]。

1）SRB法測定細(xì)胞增殖力的變化：操作步驟同1.3.1。

2）細(xì)胞內(nèi)總DNA含量的測定：調(diào)整對數(shù)期細(xì)胞密度為 5×104個/mL，每孔 200 μL接種于 96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。染毒24 h或48 h后，棄培養(yǎng)基，37℃預(yù)熱的HBSS洗一遍，將96孔板置于-80℃的冰箱中冷凍1 h，然后置于37℃水浴鍋中加熱30 min，在所有樣品孔、對照孔和空白孔中加入100 μL去離子水，再放入-80℃冰箱中冷凍1 h，37 ℃加熱 30 min后，每孔加入 100 μL 5 mg/mL的H33258染料，同時繪制小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。室溫下避光靜置30 min后用熒光酶標(biāo)儀測各孔的熒光值[7]。

3）細(xì)胞內(nèi)ATP含量的測定：調(diào)整對數(shù)期細(xì)胞密度為5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。染毒24 h或48 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入20 μL ATP裂解液（冰上操作），反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，每孔加180 μL PBS將裂解液洗出，12 000 g離心10 min后，取100 μL上清液，加入預(yù)先加有100 μL ATP檢測工作液的底部透明板中，迅速混勻后，立即用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀檢測熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出加藥組細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。

4）細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性的轉(zhuǎn)換：調(diào)整對數(shù)期細(xì)胞密度為 5×104個/mL，每孔 200 μL接種于 96孔板中孵育24 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入5 μg/mL羅丹明123工作液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO237℃孵育30 min后，1 000 r/min離心10 min，用培養(yǎng)基洗一遍，相同條件離心后加入含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，使用熒光酶標(biāo)儀測定熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出加藥組細(xì)胞內(nèi)檢測到的羅丹明123含量，判斷細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性的改變。

5）細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測定：調(diào)整對數(shù)期細(xì)胞密度為5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的PBS洗一遍后，加入37℃預(yù)熱的DCFH-DA探針（終濃度為10 μmol/L，溶解于DMEM中），37℃避光孵育30 min后，1 000 r/min離心10 min，將探針吸除，加入DMEM清洗探針，再1 000 r/min離心10 min，吸除DMEM后將各孔換為含AFB1或者ST的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，采用熒光酶標(biāo)儀檢測二氯熒光黃（DCF）的熒光強(qiáng)度[8]。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均以x±s進(jìn)行表示，使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用origin18.1軟件繪圖。用Probit analysis算出各毒素的IC50[9]。ST與AFB1混合物對HepG2聯(lián)合毒性作用類型采用成對樣本T檢驗“預(yù)測值”和“測量值”之間的顯著性差異，若P＞0.05，表示兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異，反映AFB1與ST的聯(lián)合毒性為加和作用[10]。其中，“預(yù)測值”為AFB1或ST的固定濃度產(chǎn)生的效應(yīng)值與另一種毒素的各濃度梯度單獨作用于細(xì)胞分別產(chǎn)生的效應(yīng)值的相加值；“測量值”為兩種毒素以不同濃度混合后實際測得毒素對細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)值。5個毒性作用終點采用主成分分析法（PCA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1、ST對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度

AFB1和ST對HepG2細(xì)胞增殖力的抑制率呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，根據(jù)實驗中染毒濃度對應(yīng)的細(xì)胞增殖力抑制率，使用SPSS進(jìn)行Probit analysis分析，概率為50%時對應(yīng)的濃度即為該毒素對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。兩種毒素對HepG2細(xì)胞的IC50如表1所示。從表1可看出，ST的 IC50要比AFB1的IC50低50%，說明ST對HepG2細(xì)胞的毒性高于AFB1的毒性。

2.2 AFB1、ST單獨作用及聯(lián)合作用對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖力影響

AFB1、ST對細(xì)胞的毒性作用在24 h時并沒有明顯的趨勢，48 h時細(xì)胞增殖力的降低程度基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性。如圖1所示，細(xì)胞染毒48 h后，與對照組（100%）相比，單獨作用時AFB1濃度在0.5～10 μmol/L時，細(xì)胞增殖力抑制率為 6.28%～43.59%， 呈指數(shù)型下降；ST濃度在 0.5～7 μmol/L時，細(xì)胞增殖力抑制率為24.32%～49.5%，呈線性下降；聯(lián)合作用時，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組中，ST濃度為0.5 μmol/L時的抑制率為45.39%，同單獨作用時ST的最大濃度即7 μmol/L的抑制率基本一致。并且從圖1（b）可以看出，AFB1+ST混合組的抑制率均高于單獨作用組，其中 ST（5 μmol/L）+AFB1混合組的細(xì)胞增殖力呈指數(shù)型下降，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組的增殖力呈線性下降，可以看出兩種毒素混合后并不會影響毒素自身對細(xì)胞增殖力抑制作用的變化規(guī)律。

表 1 AFB1、ST 對 HepG2的 IC50Table 1 IC50determinations of AFB1and ST in HepG2 by probit analysis

圖1 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖力的影響（48 h）Fig.1 Inhibition rate of AFB1and ST in HepG2（48 h）

2.3 AFB1、ST單獨作用及聯(lián)合作用對HepG2細(xì)胞DNA含量的影響

細(xì)胞在96孔板中經(jīng)過兩次凍融循環(huán)被破壞并釋放DNA，而H33258與雙鏈DNA結(jié)合時由非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高熒光物質(zhì)，反映了細(xì)胞中總DNA的含量。AFB1、ST對細(xì)胞DNA含量的影響在24 h時并不明顯，48 h時DNA含量的降低程度基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性。如圖2所示，細(xì)胞染毒48 h后，與對照組 （100%）相比，單獨作用時AFB1濃度在0.5～10 μmol/L 時，DNA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（相對質(zhì)量）下降為110.55%～55.21%，呈對數(shù)型下降；ST濃度在0.5～7 μmol/L時，DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為 116.27%～76.89%，下降趨勢可用乘冪回歸表示；實驗結(jié)果中細(xì)胞DNA含量在低劑量組中出現(xiàn)了高于對照組DNA含量的現(xiàn)象，可能由于低劑量的毒素未對細(xì)胞造成損傷，反而引起細(xì)胞內(nèi)的抵抗反應(yīng)，合成了較多的DNA，從而高出對照組的含量。聯(lián)合作用時，ST（5 μmol/L）+AFB1混合組中，AFB1濃度為 0.5 μmol/L時的DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為54.72%，同單獨作用時AFB1的最大濃度即10 μmol/L時的DNA含量基本一致。

圖2 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞內(nèi)DNA含量的影響（48 h）Fig.2 Effect of AFB1and ST on DNA content in HepG2 cells（48 h）

從圖2（b）可以看出，AFB1+ST混合組的DNA減少量均高于單獨組，其中 ST（5 μmol/L）+AFB1混合組的細(xì)胞增殖力呈對數(shù)型下降，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組的增殖力的下降趨勢可用乘冪回歸表示，可以看出毒素在單獨作用和聯(lián)合作用時，并不會因為另外一種毒素的混合而影響其本身對細(xì)胞的毒性作用。

2.4 AFB1、ST單獨作用及聯(lián)合作用對HepG2細(xì)胞ATP水平的影響

細(xì)胞ATP水平在24 h時已基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性，48 h時ATP含量的降低程度更加明顯。如圖3所示，細(xì)胞染毒24 h后，與對照組（100%）相比，AFB1濃度在 0.5～10 μmol/L 時，單獨作用及聯(lián)合作用時ATP含量呈線性下降；而ST單獨作用濃度在 0.5～7 μmol/L時，ATP摩爾分?jǐn)?shù)（相對物質(zhì)的量）下降為42.30%～22.21%，為乘冪型下降，與AFB1聯(lián)合作用后同樣呈乘冪型下降。ATP是5個毒性作用終點中最早對毒素產(chǎn)生顯著反應(yīng)的指標(biāo)，較早的反應(yīng)細(xì)胞的染毒狀態(tài)可以作為細(xì)胞染毒的早期檢測指標(biāo)。

圖3 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響（24 h）Fig.3 Effect of AFB1and ST on ATP content in HepG2 cells（24 h）

2.5 AFB1、ST單獨作用及聯(lián)合作用對HepG2細(xì)胞線粒體通透性的影響

羅丹明123在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）的崩潰，羅丹明123重新釋放出線粒體，發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。通過熒光信號的強(qiáng)弱，檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。如圖4所示，細(xì)胞染毒48 h后，隨著AFB1和ST濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的含量有上升的趨勢，但上升的程度并不明顯，但從圖4（b）可看出，AFB1和ST混合組中羅丹明123的含量增長率均明顯高于單獨作用組。

圖4 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性的影響（48 h）Fig.4 Effect of AFB1and ST on mitochondrial membrane permeability in HepG2 cells（48 h）

2.6 AFB1、ST單獨作用及聯(lián)合作用對HepG2細(xì)胞活性氧水平的影響

細(xì)胞中二氯熒光黃（DCF）的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞中活性氧的含量。染毒24 h后細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生并不明顯，48 h時細(xì)胞活性氧含量的增加基本呈現(xiàn)毒素劑量相關(guān)性，如圖5所示。

圖5 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響（48 h）Fig.5 Effect of AFB1and ST on reactive oxygen in HepG2 cells（48 h）

細(xì)胞染毒48 h后，與對照組（100%）相比，單獨作用時AFB1濃度在0.5～10 μmol/L時，活性氧摩爾分?jǐn)?shù)（相對物質(zhì)的量）上升為99.50%～115.29%；ST濃度在0.5～7 μmol/L時，活性氧摩爾分?jǐn)?shù)上升為106.28%～116.27%； 聯(lián)合作用時，ST （5 μmol/L）+AFB1混合組中，AFB1濃度為1 μmol/L時的ROS的摩爾分?jǐn)?shù)值為102%，同單獨作用時AFB1濃度為5 μmol/L的ROS含量基本一致。通過擬合，AFB1和ST在單獨作用和聯(lián)合作用時均呈指數(shù)型下降，并且從圖5（b）可以看出，AFB1+ST混合組的活性氧增加量均大于單獨作用組，可以得出兩種毒素混合后對HepG2細(xì)胞的毒性作用有所增強(qiáng)。

2.7 AFB1與ST混合物對HepG2細(xì)胞的聯(lián)合毒性作用

5個毒性作用終點的測量值與預(yù)測值的顯著性分析如表2所示，細(xì)胞增殖力、ATP含量、DNA含量、ROS含量及線粒體膜電位的測量值與預(yù)測值之間均無顯著性差異，表明AFB1和ST對HepG2的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為加和作用。

表2 成對樣本T檢驗分析混合物的測量值及預(yù)測值差異性Table 2 Principal component analysis of five endpoints

2.8 AFB1和ST對HepG2細(xì)胞的5個作用終點的主成分分析

AFB1及ST對HepG2細(xì)胞48 h毒性作用的PCA分析如表3所示。

根據(jù)各個作用終點在2個成分中的系數(shù)，AFB1和ST對HepG2細(xì)胞的單獨作用及聯(lián)合作用終點均可分為3類：細(xì)胞增殖力；ATP含量、DNA含量；活性氧含量（ROS）和線粒體膜通透性（MMP）。根據(jù)主成分分析分類結(jié)果，ROS的產(chǎn)生與線粒體膜通透性的下降反映了兩種毒素對細(xì)胞的同一損傷效應(yīng)。因線粒體受損后產(chǎn)生活性氧，進(jìn)一步對線粒體氧化損傷，故深入研究時，可根據(jù)分類結(jié)果選取每類中的一個指標(biāo)進(jìn)行毒素對細(xì)胞的毒性作用檢測。

表3 AFB1及ST對HepG2毒性5個作用終點的主成分分析Table 3 Principal component analysis of five endpoints

3 討論

首次得出雜色曲霉素ST在HepG2細(xì)胞中的IC50值；并且以HepG2細(xì)胞為對象，以5個毒性作用終點為依據(jù)，研究了AFB1和ST兩種真菌毒素的聯(lián)合作用類型，經(jīng)分析推斷其聯(lián)合毒性作用類型為加和作用。本實驗中5個毒性終點從不同方面檢驗了AFB1和ST對HepG2細(xì)胞的毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到毒素刺激后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降會伴隨著ATP水平的下降，同時線粒體是活性氧產(chǎn)生的主要場所，又是活性氧作用最敏感的部位，活性氧會對線粒體造成氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。5個毒性作用終點的主成分分析得知，單獨作用及聯(lián)合作用均具有共同的主成分，推測可能由于黃曲霉毒素B1與雜色曲霉素對HepG2細(xì)胞的毒性作用位點基本一致，并且具有相似的信號代謝通路，使其聯(lián)合作用的類型為加和作用。

4 結(jié)語

此次研究雖然僅從細(xì)胞水平對2種毒素的聯(lián)合作用類型進(jìn)行判斷，但采用的多指標(biāo)驗證方法為多種真菌毒素聯(lián)合作用的深入研究提供了參考。對于食品中真菌毒素的最大允許量，國家有明確的規(guī)定[12]，但規(guī)定中沒有提及兩種以上的真菌毒素共同存在時的限量標(biāo)準(zhǔn)，所以當(dāng)兩種以上毒素共存時，其含量分別符合限量標(biāo)準(zhǔn)，但如果其聯(lián)合加和或協(xié)同作用，則會對人體造成更大傷害。因此，通過研究食品中常見的真菌毒素共存時的聯(lián)合作用，可為食品安全提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

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