李亞麗，逄世峰，鄭培和，曲正義，閆梅霞，張舒娜，王英平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所新藥創(chuàng)制研究室，吉林長(zhǎng)春130122)

呋甾烷(Furosine，F(xiàn)uroylmethyllysine，F(xiàn)ML)，化學(xué)名稱 ε-N-2－呋喃甲基-L-賴氨酸，又名呋甾素、糠氨酸，乳品中常稱糠氨酸［1－2］。FML通常是食品或藥材(藥品)中蛋白質(zhì)(或氨基酸)與還原糖在高溫炮制或長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)發(fā)生Maillard反應(yīng)產(chǎn)生的系列糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)之一，常作為判斷蜂蜜和牛奶等產(chǎn)品新鮮度或營(yíng)養(yǎng)損傷程度以及藥材炮制品質(zhì)的一重要指標(biāo)［3－4］。亦有大量研究表明，人體內(nèi)糖基化終產(chǎn)物是老年性疾病的介導(dǎo)因素，可作為測(cè)試人體老化進(jìn)程的時(shí)鐘。

蜂王漿中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及還原糖，因此在一定條件下會(huì)發(fā)生Maillard反應(yīng)。Marconi等測(cè)定了蜂王漿中FML的含量，并對(duì)使用FML作為評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度的指標(biāo)進(jìn)行了可行性研究［5］。在奶粉制造過(guò)程中適宜的反應(yīng)條件可導(dǎo)致FML的生成，加入復(fù)原乳的液態(tài)奶中FML含量急劇增加，而且FML與乳果糖的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于液態(tài)奶［6］。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2005年發(fā)布農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》［7］，其根據(jù)FML和乳果糖2種物質(zhì)在液態(tài)乳中的含量，判定巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中是否含復(fù)原乳成分。人參等中藥材富含氨基酸、蛋白質(zhì)和還原糖，儲(chǔ)存和炮制過(guò)程常發(fā)生Maillard反應(yīng)，產(chǎn)生多種Maillard產(chǎn)物，如麥芽酚、精氨酸雙糖苷等報(bào)道較多，而FML報(bào)道較少。另外，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ML等AGEs的含量在一些人體老化疾病的膠原蛋白和血漿中的含量比正常人高，與人體健康密切相關(guān)。

筆者從FML的生化特性與結(jié)構(gòu)、生成機(jī)理、測(cè)試方法和抑制策略4個(gè)方面進(jìn)行闡述，為完善現(xiàn)行食品或藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步規(guī)范食品藥品市場(chǎng)和確保人體健康提供一定參考。

1 生化特性與結(jié)構(gòu)

呋甾烷，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。FML已經(jīng)被證實(shí)與多種疾病密切相關(guān)，食入過(guò)量對(duì)人體有害;同時(shí)體內(nèi)糖含量較高時(shí)，亦可內(nèi)源合成。研究表明，F(xiàn)ML等AGEs能直接損傷神經(jīng)組織或和其受體相互作用導(dǎo)致神經(jīng)病變，參與白內(nèi)障、動(dòng)脈硬化、阿耳茨海默氏病、糖尿病、腎炎、網(wǎng)膜癥、神經(jīng)障礙和心腦血管等人體老化疾病的發(fā)生［8－10］，而且食品和藥品有可能是最主要的攝取途徑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ML等AGEs的存在還與衰老有著緊密的聯(lián)系。在人類和動(dòng)物的多種組織中隨著年齡的增長(zhǎng)不斷積聚，可作為研究衰老的一項(xiàng)重要指標(biāo)。它隨著年齡的增長(zhǎng)，在血清、組織中的生成和積聚是不可避免的。其對(duì)酶類有高度的抵抗作用，更新周期長(zhǎng)，且具有高交聯(lián)性，能改變有關(guān)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，并能與其特異性受體相互作用，通過(guò)多種途徑造成組織的交聯(lián)損傷，或者誘發(fā)突變，造成正常蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成老年蛋白的結(jié)構(gòu)，隨著年齡增長(zhǎng)在體內(nèi)積聚增多，會(huì)造成人體內(nèi)血管壁硬度增加;或通過(guò)直接或間接的作用導(dǎo)致骨代謝的失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松［11］。FML等AGEs存在還會(huì)使大腦神經(jīng)中樞的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)與功能的變化。

圖1 FML結(jié)構(gòu)式

2 生成機(jī)理

由圖2可知，F(xiàn)ML是Maillard反應(yīng)的AGEs之一，在該反應(yīng)中，氨基酸與還原糖首先縮合生成Shiff堿;該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，可自行發(fā)生重排而生成Amadori化合物(1-氨基-1-脫氧-2-酮糖)，然后再降解為A-酮醛化合物，它比單糖更易與蛋白質(zhì)反應(yīng)，尤其是容易進(jìn)一步生成棕褐色、具有熒光性的不可逆產(chǎn)物;FML是Amadori化合物在酸性條件下的產(chǎn)物之一，在生物體內(nèi)的消化酶則不能解離。因此，這種氨基酸被稱為無(wú)效氨基酸。FML能夠反映早期Maillard反應(yīng)的程度，已被作為很多食品或藥品在常溫儲(chǔ)存的貨架期或炮制品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。在糖尿病或其他老齡化疾病人體中，體內(nèi)葡萄糖(或果糖)與體內(nèi)多種蛋白質(zhì)或氨基酸等物質(zhì)發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，已經(jīng)證實(shí)這是一個(gè)依賴于血糖濃度的化學(xué)反應(yīng)，血糖越高，其合成量就越多。由于還原糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合無(wú)特異性，它可以與體內(nèi)各種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)，從而在相應(yīng)的組織或器官中形成AGEs，而且具有不可逆性，既使血糖被糾正，AGEs的水平也不能恢復(fù)到正常狀態(tài)，而在組織中蓄積［12－13］。

圖2 以葡萄糖和賴氨酸為代表的呋甾烷形成機(jī)理

3 測(cè)試方法

目前，F(xiàn)ML的測(cè)定方法有反相離子對(duì)色譜法、熒光光譜法、表面熒光法、近紅外光譜法，液－質(zhì)法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。下面簡(jiǎn)單對(duì)各種分析方法進(jìn)行介紹，并對(duì)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析。

3.1 反相液相色譜法 反相色譜被廣泛應(yīng)用于FML的分析，大多是針對(duì)蜂蜜產(chǎn)品和乳制品等食品中FML的測(cè)定。選擇特定的紫外波長(zhǎng)或者熒光激發(fā)檢測(cè)FML。FML是一種強(qiáng)極性的水溶性化合物，大多情況下與蛋白質(zhì)結(jié)合，因此，進(jìn)行FML測(cè)定時(shí)一般需要水解，水解液后期常需要過(guò)濾和C18柱預(yù)萃取、高濃度鹽酸溶液定容等前處理過(guò)程，回收率較低。FML是強(qiáng)極性化合物，采用反相色譜法測(cè)定時(shí)，保留時(shí)間太短，干擾也較大。因此在測(cè)定時(shí)，需要在流動(dòng)相中添加三氟乙酸或七氟丁酸等離子對(duì)試劑，將FML帶回到疏水的反相表面，優(yōu)化分離條件、增大復(fù)雜色譜分析的靈敏度［14－15］。但三氟乙酸或七氟丁酸的強(qiáng)腐蝕性會(huì)使色譜柱柱效很快降低，不適用于長(zhǎng)期穩(wěn)定的測(cè)定FML，該方法分離度及重復(fù)性會(huì)隨進(jìn)樣次數(shù)發(fā)生變化，而且樣品中的高濃度鹽酸對(duì)色譜柱及儀器管路均會(huì)造成一定的損壞，國(guó)內(nèi)通用的ODS柱很難耐受，而進(jìn)口色譜柱成本較高。后來(lái)研究者對(duì)方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了以1-庚烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑的反相離子對(duì)分析方法，消除了三氟乙酸或七氟丁酸對(duì)儀器及色譜柱的影響，優(yōu)化了色譜分離條件［16－17］。反相液相色譜法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度較高、被測(cè)組分出峰時(shí)間較快，具有較好的可操作性。但是HPLC缺點(diǎn)在于色譜柱造價(jià)高、易損失，且前期處理時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24 h。

3.2 熒光光譜法 描述物質(zhì)的熒光特性有激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)、發(fā)射波長(zhǎng)(Em)和熒光強(qiáng)度3個(gè)參數(shù)。FML的最大激發(fā)波長(zhǎng)是330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm［18］。熒光分析法測(cè)定有以下3個(gè)特定的優(yōu)勢(shì):①熒光分析法比其他分光光度技術(shù)靈敏100～1 000倍;②大多數(shù)熒光方法快捷、處理步驟相對(duì)簡(jiǎn)便;③熒光化合物對(duì)環(huán)境極其靈敏。

3.3 表面熒光法 熒光分光光度法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，比常規(guī)分光光度法靈敏度高10～100倍。但普通熒光方法有其自身的局限性，當(dāng)樣品的吸光度＞0.1時(shí)，發(fā)射光透出會(huì)遇到很大阻礙，普通熒光方法就已不再適用。表面熒光方法是一種在普通熒光方法基礎(chǔ)上新發(fā)展起來(lái)的一種方法，通過(guò)將比色杯旋轉(zhuǎn)56°角，只對(duì)比色杯表面一層的待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，適用于不透明的樣品，省去了很多對(duì)樣品前處理的步驟，適用于快速檢測(cè)。在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm時(shí)，用普通熒光方法在波長(zhǎng)410 nm左右得到熒光峰，而用表面熒光方法在波長(zhǎng)425 nm處得到熒光峰。其特點(diǎn)是:FML含量低，熒光方法靈敏度高;表面熒光方法不用對(duì)樣品進(jìn)行前處理，快速簡(jiǎn)便［19］。

3.4 近紅外光譜法 近紅外光譜(Near Infrared，NIR)是波長(zhǎng)范圍在780～2 526 nm的電磁波，近紅外光譜方法利用有機(jī)物中含有C－H、N－H、O－H、C－C等化學(xué)鍵的泛頻振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，以漫反射方式獲得在近紅外區(qū)的吸收光譜，通過(guò)主成分分析、偏最小二乘法、人工神經(jīng)網(wǎng)等現(xiàn)代化學(xué)和計(jì)量學(xué)方法，建立物質(zhì)光譜與待測(cè)成分含量間的線性或非線性模型，從而實(shí)現(xiàn)采用物質(zhì)近紅外光譜信息對(duì)待測(cè)成分含量進(jìn)行計(jì)量。近紅外光譜技術(shù)可以有效地對(duì)乳制品的營(yíng)養(yǎng)成分含量以及摻假物、殘留物和防腐劑等進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、無(wú)損地測(cè)定，從而檢測(cè)牛乳及其乳制品質(zhì)量［20－21］。

3.5 液－質(zhì)法 HPLC-MS是有力的定性定量工具，Villamiel等報(bào)道了HPLC-MS法測(cè)定蜂蜜中FML含量。采用選擇離子檢測(cè)方式，用于定量分析檢測(cè)離子質(zhì)荷比m/z為255的［FML+H］+。結(jié)果表明，長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的蜂蜜中FML的含量高于10g/kg，同時(shí)蛋白質(zhì)的含量減少。采用質(zhì)譜法檢測(cè)FML的重現(xiàn)性好，精密度高，檢測(cè)定量限(LOQ)低［22］。

3.6 ELISA法 ELISA法檢測(cè)FML的方法類似于檢測(cè)其他AGEs。采用ELISA試劑盒檢測(cè)ELISA水平時(shí)，純化的ELISA抗體包被微孔板，并制成固相抗體，微孔中依次加入抗原ELISA和酶標(biāo)抗體，形成抗體－抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物。FML最后結(jié)合在固相載體上的酶量與其總量有一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中FML抗原的總量直接相關(guān)，用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，F(xiàn)ML的總量與吸光度值成正比，然后通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中FML的總量。在一般情況下，ELISA法檢測(cè)FML的優(yōu)點(diǎn)是快速，價(jià)格相對(duì)便宜。缺點(diǎn)是容易受到雜質(zhì)的干擾，精確度值得懷疑。而且，ELISA法中的抗原或抗體主要來(lái)自于人體或者動(dòng)物體內(nèi)，其用于檢測(cè)食源性FML的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步的鑒定。

4 抑制策略

FML等AGEs是導(dǎo)致各種糖尿病慢性并發(fā)癥及衰老發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)物質(zhì)，因此減少或消除體內(nèi)的FML等AGEs則是預(yù)防糖尿病并發(fā)癥及衰老的一個(gè)理想途徑。因此，抑制FML的形成或者阻斷其生成是控制糖尿病慢性并發(fā)癥及衰老的關(guān)鍵。而FML的來(lái)源主要是2個(gè)方面:一是內(nèi)源性還原糖的合成;二是食品及藥品中FML的直接攝入。內(nèi)源性合成方面最初認(rèn)為Glu是FML形成的主要前體物，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其他一些糖類、非糖類活性更高，更利于FML形成，如Fru和甘油醛等，因此應(yīng)減少低血糖生成指數(shù)膳食。

外源性攝入則需要從食品和藥品儲(chǔ)存和加工方面加以控制。首先，F(xiàn)ML等AGEs一般認(rèn)為是Maillard反應(yīng)的產(chǎn)物之一，所以得從Maillard反應(yīng)條件控制入手;研究者在探索抑制FML形成的途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑能明顯抑制蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)，從而抑制FML的形成［23-24］。同時(shí)，大量的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物對(duì)熒光性AGEs、FML和戊糖素(pentosidine)等有抑制作用，其抑制機(jī)理與抗氧化性和清除自由基的作用相聯(lián)系，抑制作用主要發(fā)生在糖基化反應(yīng)的前期階段。氨基胍已用做治療糖尿病，其抑制效果是通過(guò)抑制還原糖與蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，達(dá)到抑制AGEs生成的目的［25］。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，蜂蜜及奶粉等產(chǎn)品中FML的測(cè)定及抑制已得到研究者的廣泛關(guān)注，但是對(duì)藥材(藥品)中FML的生成及調(diào)控研究的較少，今后應(yīng)加強(qiáng)藥材(藥品)中FML的生成及調(diào)控研究;另一方面，對(duì)FML的生成和抑制研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但其抑制機(jī)理尚不清楚。今后應(yīng)加強(qiáng)從動(dòng)力學(xué)的角度研究抑制FML的抑制位點(diǎn)和抑制機(jī)理，從而為抑制食品、藥品儲(chǔ)藏和加工過(guò)程產(chǎn)生FML提供理論基礎(chǔ)和參考，確保食品藥品質(zhì)量和人體健康。

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