劉晨濤，王旭丹，唐 量

(1.西北大學(xué)體育部，陜西西安 710069;2.陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西西安 710062)

運(yùn)動作為降低體脂最安全有效的方法一直被 國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。目前研究表明，作為運(yùn)動主要的兩種方式，抗阻力運(yùn)動較有氧運(yùn)動對促進(jìn)體質(zhì)代謝效果更佳而成為研究熱點，張獻(xiàn)輝等［1］研究發(fā)現(xiàn)抗阻運(yùn)動能有效增加IR患者肌力，減少脂肪組織，調(diào)控血糖水平效果;Kraemer W J等［2］通過控制飲食對比有氧和抗阻訓(xùn)練對脂代謝的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12周抗阻力訓(xùn)練后，機(jī)體脂代謝作用較有氧訓(xùn)練高出19%;Cauza E等［3］對10例2型糖尿病患者進(jìn)行為期4個月的抗阻和有氧運(yùn)動訓(xùn)練，結(jié)果顯示抗阻力運(yùn)動組血脂TC，TG，LDL等指標(biāo)下降幅度大于有氧運(yùn)動組。研究表明，高強(qiáng)度較低強(qiáng)度抗阻運(yùn)動對血糖和HbA1c水平控制效果更好［4］，但由于一般IR人群身體條件較差，所以普遍采用中等強(qiáng)度(50% ～60%自體重)抗阻運(yùn)動方式。

MSTN是骨骼肌生長發(fā)育的主要負(fù)調(diào)因子之一，其基因失活或突變會導(dǎo)致“雙肌”出現(xiàn)［5］。目前大量研究報道MSTN與脂代謝之間的密切關(guān)系，如 N K LeBrasseur［6］研究表明，抑制 MSTN 表達(dá)對降低體內(nèi)脂肪以及改善2型糖尿病都有很好的作用。在臨床實驗中將MSTN抗體用于骨骼肌生長不良患者中，結(jié)果表明，MSTN抗體具有安全性以及可行性，因此我們提出假設(shè)能否讓運(yùn)動與藥物二者共同干預(yù)胰島素大鼠體脂代謝，即選擇中強(qiáng)度抗阻運(yùn)動聯(lián)合MSTN抗體共同干預(yù)，觀測其是否能更好地促進(jìn)IR大鼠體脂代謝。此外Bueno［7］曾研究表明，運(yùn)動后MSTN表達(dá)在骨骼肌和脂肪中的表達(dá)水平均會顯著性降低，Santos在8周的不同強(qiáng)度的抗阻力訓(xùn)練中研究發(fā)現(xiàn)，MSTN抑制劑蛋白都明顯升高［8］，因此推測抗阻力運(yùn)動是否是通過降低MSTN含量表達(dá)，也是本次研究關(guān)注的另一個方向。

1 材料與方法

1.1 MSTN抗體的制備

在上海生工有限公司合成Myostatin原核基因表達(dá)載體，后將重組質(zhì)粒pQE-Ms轉(zhuǎn)染大腸桿菌表達(dá)，提純MSTN蛋白。

1.2 實驗對象與分組

健康雄性SD大鼠50只，8周齡、體重為180～200g，購自于西安交通大學(xué)動物中心(陜醫(yī)動證字:08-004號)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)挑選10只分為正常對照組(NC組)，剩余40只為高脂膳食組(HF組)隨機(jī)分為高脂對照組(HFC組)、高脂抗體對照組(HF+MsAb組)、高脂中強(qiáng)度爬梯抗阻力運(yùn)動(HF+MRT組)，共5組，每組10只。NC組用普通飼料喂養(yǎng)，HF組參考 Heinemeier［9］配制的高脂飼料喂養(yǎng)(基礎(chǔ)飼料55%，牛油25%，蛋黃粉15%，其他5%)飼養(yǎng)環(huán)境為高度清潔，自然光照，大鼠自由飲水和取食，室溫22℃ ～26℃，相對濕度50%左右。

1.3 運(yùn)動方案與取材

8周高脂膳食后通過口服葡萄糖耐受實驗(Oral glucose tolerance test，OGTT)和胰島素敏感性測試(Insulin sensitivity tests，IST)評價［10］IR 模型的建立，然后將HF組的IR大鼠分別進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)治療。中強(qiáng)度抗阻力爬梯(爬梯專利號:201020279841.8)［11］運(yùn)動負(fù)荷組第1周為30%自體重，之后每周按60%自體重，每周3天，每天3組，每組10次，組間休息5min，每次間隔1min(圖1)［12］;MSTN抗體組注射劑量為40mg/kg體重，10d/次，共4次;MSTN抗體與爬梯抗阻力聯(lián)合干預(yù)是將二者干預(yù)方式相結(jié)合。

待8周干預(yù)結(jié)束后禁食12h取材:用無菌的試管收集血，放在37℃恒溫水浴鍋中水浴30min使血液凝固后挑去血塊，在4℃離心機(jī)中3 000 r/min*15min，抽取上清液，標(biāo)記好后分裝，在-80℃冰箱內(nèi)凍存待測。

圖1 大鼠中強(qiáng)爬梯負(fù)重訓(xùn)練圖Fig.1 Rats in the medium ladder resistance training

1.4 大鼠血脂指標(biāo)分析

血清中膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)等按試劑盒中的實驗步驟進(jìn)行操作測定。

1.5 主要試劑

主要試劑:南京建成生物公司 TC，HDL，LDL，TG，F(xiàn)FA等生化試劑盒。

1.6 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示。采用One-Way ANOVA進(jìn)行分析，顯著性水平選擇p＜0.05和p＜0.01水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 MSTN抗體制備結(jié)果

實驗成功制備效價為1∶10 000 MSTN特異性抗體(圖2)。通過用WB、免疫組化等技術(shù)鑒定了其特異性，制備后的抗體存放至-20℃冰箱以備后用(圖3，4)。

圖2 MSTN抗體的制備Fig.2 The preparation of MSTN antibody

圖3 MSTN抗體過蛋白A柱WB圖Fig.3 WB of MSTN antibody

2.2 IR建模結(jié)果

8周高脂膳食后通過OGTT測試表明:NC組和HF組在灌胃葡萄糖后30min，HF組血糖顯著高于NC組(p＜0.05)，NC組在60min，90min血糖逐漸下降，120min基本恢復(fù)到正常。HF組在60min出現(xiàn)峰值之后血糖也逐漸下降，在120min保持較高的血糖水平。HF組血糖在60min，90min，120min水平較NC組都有顯著性差異(p＜0.01)。因此，OGTT結(jié)果可以證明，大鼠IR模型建立成功。IST測定結(jié)果表明:NC組在注射胰島素后30min，60min，90min血糖持續(xù)下降，較 HF組具有顯著性差異(p＜0.01)，NC組、HF組在90min后血糖開始回升。HF組血糖降幅較小，說明高脂膳食大鼠胰島素敏感性下降。因此，IST結(jié)果也證明了IR模型的成功建立。

圖4 MSTN抗體免疫組化Fig.4 Immunohistochemistry of MSTN antibody

2.3 血脂指標(biāo)結(jié)果

取各組大鼠血清，測定大鼠TC，HDL，LDL等指標(biāo)，結(jié)果表明:HFC組與NC組相比TC，HDL，LDL含量增高，分別具有顯著性差異(p＜0.05，p＜0.01);與HFC組大鼠相比，MSTN抗體、抗阻中強(qiáng)度以及二者聯(lián)合都使得大鼠TC，LDL含量降低，部分指標(biāo)有極顯著性差異(p＜0.01);與HF+MsAb組相比HF+MsAb+MRT組HDL血脂指標(biāo)含量增高并具有顯著性差異(p＜0.05)，LDL指標(biāo)較HF+MsAb組和HF+MRT組相比均有降低，具有顯著性差異(p＜0.05)(圖5)。

TG，F(xiàn)FA實驗結(jié)果表明:與NC組相比，HFC組TG，F(xiàn)FA含量顯著性增高(p＜0.01);干預(yù)組結(jié)果表明，HF+MsAb+MRT組與HF+MsAb組及HF+MRT組相比TG指標(biāo)有明顯下降，其中與HF+MRT組具有差異(p＜0.05)，運(yùn)動聯(lián)合抗體組與HF+MsAb組及HF+MRT組FFA指標(biāo)相比較明顯下降，并與二者均具有極顯著性差異(p＜0.01)(圖6)。

3 討論

研究表明，MSTN基因敲出可使機(jī)體能量代謝增加［13］，降低體脂含量，但有關(guān)MSTN蛋白活性抑制劑對改善體脂方面的文獻(xiàn)報道較少。本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上研制MSTN抗體，以達(dá)到抑制MSTN蛋白活性促進(jìn)脂質(zhì)代謝的作用。結(jié)果表明，本實驗成功地制備了效價為1∶10 000 MSTN抗體，經(jīng)WB和免疫組等檢測滿足后續(xù)實驗要求。通過分析不同方式干預(yù)大鼠血脂的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，MSTN抗體組總膽固醇含量較HFC組下降了22%，效果顯著;與膽固醇代謝密切相關(guān)的指標(biāo)是HDL和LDL，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSTN抗體組較HFC組 HDL含量升 14.8%，LDL含量下降9.2%，表明了MSTN抗體對膽固醇代謝的良好效果，并有效降低了心血管疾病的發(fā)生。TG是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是機(jī)體含量最多的脂類，F(xiàn)FA是由脂肪分解后的供能物質(zhì)，這兩個指標(biāo)升高會導(dǎo)致組織對葡萄糖的攝取減少，會加重IR的發(fā)展［14］，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSTN抗體組較HFC組 TG含量下降19.3%，F(xiàn)FA下降0.09%，效果顯著，基于這些研究結(jié)果，我們可以證明MSTN抗體對改善脂代謝的良好作用。此外，有關(guān)文獻(xiàn)也報道了抗阻力運(yùn)動對改善機(jī)體成分有良好的作用，Ryan AS［15］，Gaddam KK 等［16］的研究結(jié)果不僅表明抗阻運(yùn)動使機(jī)體有效增加瘦體重，提高肌肉體積及橫斷面積，而且對機(jī)體代謝糖原、甘油三脂和蛋白質(zhì)等能源物質(zhì)有顯著的效果，從根本上降低代謝紊亂的狀態(tài)。本實驗選用中等強(qiáng)度抗阻力爬梯運(yùn)動，經(jīng)過8周干預(yù)，與HFC組相比較，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中強(qiáng)度抗阻運(yùn)動組顯著改善高脂大鼠體血脂指標(biāo)，其中FFA下降8.1%具有顯著性差異(p＜0.05)，表明了中強(qiáng)度抗阻力運(yùn)動對降低IR大鼠體脂的良好效果。

圖5 大鼠血脂指標(biāo)TC，HDL，LDL變化Fig.5 The changes of TC，HDL，LDL in different groups

圖6 大鼠血脂指標(biāo)TG，F(xiàn)FA變化Fig.6 The changes of TC，HDL，LDL in different groups

有關(guān)如何促進(jìn)體脂代謝的研究非常多，有運(yùn)動療法或藥物療法。但是，運(yùn)動聯(lián)合藥物改善體脂代謝的很少，抗阻力聯(lián)合藥物對改善體脂的研究更是沒有。本實驗在此思路上選擇了MSTN抗體聯(lián)合抗阻運(yùn)動對IR患者脂質(zhì)改善研究，實驗結(jié)果如實驗前提出的假設(shè)，運(yùn)動聯(lián)合藥物對促進(jìn)體脂代謝出現(xiàn)了效果疊加，為治療IR患者改善脂質(zhì)代謝提供了新的思路和實驗依據(jù)。此外，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，我們推測抗阻力運(yùn)動是否通過抑制MSTN分子來降低體脂含量，王靜等［17］曾研究抗阻力運(yùn)動能夠通過抑制MSTN表達(dá)，而本實驗結(jié)果中得到了抗阻力運(yùn)動與MSTN抗體聯(lián)合后效應(yīng)疊加，且MSTN抗體組較中強(qiáng)抗阻運(yùn)動組對IR大鼠體脂改善的更加明顯，說明存在抗阻運(yùn)動通過抑制MSTN而促進(jìn)脂代謝的這種可能性，而抗阻運(yùn)動是否通過抑制MSTN的信號分子或參與MSTN信號蛋白干預(yù)脂代謝的影響等還不清晰，需要后續(xù)實驗對分子機(jī)制做進(jìn)一步的研究論證。

4 結(jié)語

中強(qiáng)度爬梯抗阻運(yùn)動和MSTN抗體對高脂胰島素抵抗模型大鼠的脂質(zhì)代謝均有較好的改善作用，二者聯(lián)合改善效果顯著優(yōu)于單一因素干預(yù)，此研究為抗阻運(yùn)動聯(lián)合藥物，為IR患者改善體脂代謝提供了新的思路和實驗依據(jù)。

［1］ 張獻(xiàn)輝，李娟，崔洪成，等.有氧運(yùn)動、抗阻訓(xùn)練與2型糖尿病康復(fù)［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(5):479-482.

［2］ KRAEMER W J，VOLEK J S，CLARK K L，et al.Influence of exercise training on physiological and performance changes with weight loss in men［J］.Med Sci Sports Exerc，1999，31(9):1320-1329.

［3］ CAUZA E，HANUSCH-ENSERER U，STRASSER B，et al.The relative benefits of endurance and strength training on the metabolic factors and muscle function of people with type 2 diabetes mellitus［J］.Arch Phys Med Rehabil，2005，86(8):1527-1533.

［4］ GOTSHALK L A，BERGER R A，KRAEMER W J.Cardiovascular responses to a high-volume continuous circuit resistance training protocol［J］.J Strength Cond Res，2004，18(4):760-764.

［5］ MCPHERRON A C，LAWLER A M，LEE S J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member［J］.Nature，1997，387(6628):83-90.

［6］ LEBRASSEUR N K.Building muscle，browning fat and preventing obesity by inhibiting myostatin［J］.Diabetologia，2012，55:13-17.

［7］ BUENO P G，BASSI D，CONTRERA D G，et al.Post-exercise changes in myostatin and actRIIB expression in obese insulin-resistant rats［J］.Molecular and Cellular Endocrinology.2011，339:159-164.

［8］ SANTOS A R，LAMAS L，UGRINOWITSCH C，et al.Different Resistance-Training Regimens Evoked a Similar Increase in Myostatin Inhibitors Expression［J］.Int J Sports Med，2015，36.

［9］ HEINEMEIER K M，OLESEN J L，SCHJERLING P，et al.Short-term strength training and the expression of MSTN and IGF-I isoforms in rat muscle and tendon differential effects of specific contraction types［J］.Journal of Applied Physiology，2007，102(2):573-581.

［10］張全江.長期有氧運(yùn)動通過Akt-eNOS信號機(jī)制增強(qiáng)心肌胰島素敏感性［D］.西安:第四軍醫(yī)大學(xué)，2007.

［11］唐量，王園麗.動物抗阻力訓(xùn)練用爬梯［P］.專利號:ZL2010.20279841.8.

［12］沙曉林，馬繼政，牛潔，等.抗阻力訓(xùn)練計劃的設(shè)計［J］.南京體育學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，6(2):30-33.

［13］唐量，劉晨濤，王園麗，等.融合Th細(xì)胞表位序列Myostatin重組基因疫苗的構(gòu)建及其對免疫動物肌肉力量的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29(1):16-19.

［14］BODEN G.Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM［J］.Diabetes，1997，46(1):3-10.

［15］ RYAN A S.Exercise in aging:its important role in mortality，obesity and insulin resistance［J］.Aging health，2010，6(5):551-563.

［16］GADDAM K K，VENTURA H O，LAVIE C J.Metabolic syndrome and heart failure the risk，paradox，and treatment［J］.Curr Hypertens Rep，2011，13(2):142-148.

［17］王靜，盧健.抗阻練習(xí)模型大鼠骨骼肌中胰島素生長因子1和肌肉生長抑制素的變化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，20(15):3649-3652.