趙狀軍，胡龍興，胡濤，傅金民

（中國(guó)科學(xué)院武漢植物園，植物種質(zhì)資源創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430074）

高溫是限制植物分布、生長(zhǎng)和生產(chǎn)力的主要環(huán)境因子之一［1］。高溫對(duì)植物的影響首先表現(xiàn)在表觀形態(tài)，進(jìn)而影響植物正常生理代謝。大量研究表明，高溫會(huì)影響植物體外觀形態(tài)、光合作用、呼吸作用、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、糖、脂及氨基酸代謝等一系列生理生化過(guò)程［2－4］。短時(shí)間的極端高溫會(huì)使葉片失水萎蔫枯黃、根系褐變等［5］。長(zhǎng)時(shí)間的亞高溫會(huì)使植物發(fā)生一系列的生長(zhǎng)障礙，如葉片和根系生長(zhǎng)受阻、植株早衰，甚至導(dǎo)致植株死亡［6－7］。

代謝組學(xué)在植物逆境研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。Cramer等［8］比較了葡萄在脫水和鹽脅迫下的代謝譜，分析發(fā)現(xiàn)脫水處理的植物含有更高濃度的葡萄糖、蘋果酸和脯氨酸。Du等［9］利用GC－MS技術(shù)測(cè)定分析了C4植物狗牙根（Cynodondactylon）和C3植物草地早熟禾（Poapratensis）在高溫脅迫下的代謝產(chǎn)物的差異，認(rèn)為高溫脅迫下不同初級(jí)代謝產(chǎn)物的積累量是對(duì)高溫響應(yīng)差異的主要原因。Kaplan等［10］借助GC－MS技術(shù)研究了其在高溫與低溫環(huán)境下野生型擬南芥（Arabidopsisthaliana）的代謝指紋圖譜，分析發(fā)現(xiàn)與高溫脅迫相比，低溫脅迫更顯著地影響了野生型擬南芥代謝產(chǎn)物的改變。Rizhsky等［11］的代謝譜分析顯示，在劇烈的脫水和熱脅迫結(jié)合處理的擬南芥中，蔗糖將會(huì)取代脯氨酸作為主要的滲透保護(hù)劑。Wienkoop等［12］使用GC－MS代謝組學(xué)研究擬南芥響應(yīng)熱休克和冷休克的代謝產(chǎn)物變化發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)熱休克所產(chǎn)生的大部分代謝產(chǎn)物與冷休克響應(yīng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是重疊的。結(jié)果表明包含有脯氨酸、蔗糖、肌醇和棉子糖等相容性溶質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)耐受溫度脅迫具有重要作用。

高羊茅（Festucaarundinacea）是一種亞熱帶和溫帶地區(qū)常用的冷季型草坪草種，成坪快，綠期長(zhǎng)，抗逆性強(qiáng)，耐酸、耐瘠薄，其抗旱特性和耐熱性在冷季型草坪中首屈一指［13－14］。高羊茅無(wú)論作為牧草，還是草坪草，都有著十分廣闊的應(yīng)用前景。然而高溫嚴(yán)重限制了高羊茅的種植及推廣。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)高羊茅耐熱性的研究多數(shù)集中在外觀形態(tài)、生理生化和基因表達(dá)變化的研究［14－16］，而缺乏從代謝組學(xué)方面來(lái)研究高溫對(duì)高羊茅代謝影響的報(bào)道。本研究以不同耐熱性高羊茅基因型PI 578718（耐熱）和PI 234881（熱敏感）為試驗(yàn)材料，經(jīng)人工模擬高溫處理，通過(guò)表型和生理評(píng)價(jià)其耐熱性的差異，同時(shí)對(duì)初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定分析，以期明確高溫對(duì)不同耐熱性高羊茅初級(jí)代謝的影響，從代謝途徑上揭示高羊茅的耐熱機(jī)理，為高羊茅的遺傳改良和耐熱品種選育提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)

試驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)高溫試驗(yàn)篩選出的一個(gè)耐熱型高羊茅基因型（PI 578718）和一個(gè)熱敏感型高羊茅（PI 234881）。兩份高羊茅材料通過(guò)人工擴(kuò)繁，培養(yǎng)在褐炭土和細(xì)沙按質(zhì)量比1∶1的土壤基質(zhì)中，間隔2d澆灌半劑量的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)進(jìn)行自來(lái)水噴灌并定期修剪，培養(yǎng)2個(gè)月后進(jìn)行后續(xù)高溫試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 采用盆栽試驗(yàn)，培養(yǎng)基質(zhì)為褐炭土和細(xì)沙按質(zhì)量比1∶1混勻。試驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院武漢植物園的人工智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)箱設(shè)置處理組溫度為白天40℃，晚上30℃；對(duì)照組溫度為白天25℃，晚上20℃；相對(duì)濕度75%；光強(qiáng)600μmol／（m·s）；光周期14h／10h。共處理21d，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別在0，2，6，14，21d取葉片樣進(jìn)行測(cè)定，在0，6，21d取根系樣進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 草坪質(zhì)量打分：采用9分制目測(cè)評(píng)估，評(píng)估內(nèi)容包括色澤、均一性、質(zhì)地、草坪蓋度。9分為葉片綠色均勻，基本無(wú)枯黃，質(zhì)地較好，0分為完全枯黃，6分為可接受的草坪質(zhì)量。

葉片相對(duì)含水量的測(cè)定參照鄒琦［17］的稱量法；相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參照鄒琦［17］的電導(dǎo)法；根系活力的測(cè)定參照鄒琦［17］的TTC法并略加修改。

葉綠素含量的測(cè)定參照郭慧娟等［18］的方法。取完全展開(kāi)的功能葉片0.1g，放入含10mL二甲亞砜（MDSO）的離心管中，黑暗中放置48h（至葉片失綠透明），每天搖勻一次。吸取1mL萃取液于比色皿中，加入二甲亞砜2mL，混勻后，以二甲亞砜為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)測(cè)定OD663、OD645值。并按下列公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量。

初級(jí)代謝產(chǎn)物的測(cè)定：代謝產(chǎn)物浸提參照Roessner等［19］的方法并略加修改后，通過(guò)GC－MS技術(shù)參照Du等［9］的方法對(duì)浸提物中的初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。具體流程如下：

1）樣品提?。壕_稱取液氮研磨后的樣品0.1g，加入1.4mL 100%的甲醇，同時(shí)加入20μL濃度為2 mg／mL的核糖醇作為極性成分的內(nèi)標(biāo)，室溫提取2h后放入金屬浴中70℃恒溫15min，然后12000r／min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入10mL離心管中，加入750μL氯仿和1.5mL純凈水，渦旋混勻后于12000r／min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液（極性相）移至新離心管中。

2）衍生化：上清液300μL至2mL進(jìn)樣瓶中，在真空濃縮儀（900r／min，30℃，2h）中真空濃縮至完全干燥后加入80μL濃度為20mg／mL鹽酸甲氧胺，37℃振蕩2h，然后再加入50μL MSTFA至樣品中，37℃200r／min振蕩2h后進(jìn)樣分析。

3）氣相色譜和質(zhì)譜條件：采用安捷倫5975－7890色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定分析，色譜柱為DB－5ms（30mm×0.25 mm，0.25μm）毛細(xì)管柱，載氣為氦氣（99.999%），流速為1mL／min。進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL。升溫程序：70℃保持5min，以每分鐘5℃的速率升至300℃，溫度最終升高至310℃，保持10min，并在下次進(jìn)樣前70℃平衡1min。質(zhì)譜采用電子轟擊（electron impact，EI）離子源，電子能量為70eV，傳輸線溫度為260℃，離子源溫度為200℃，掃描速度0.6scan／s，溶劑延遲時(shí)間為6min，質(zhì)量掃描范圍為50～600m／z。

將從GC－MS分析儀上得到的數(shù)據(jù)文件以簡(jiǎn)單模式方式分析，所有色譜峰通過(guò)Varian300自帶軟件和NIST進(jìn)行比對(duì)，然后運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用化學(xué)工作站（Agilent MSD Productivity Chemstation），通過(guò)比對(duì)出峰時(shí)間、荷質(zhì)比和保留指數(shù)對(duì)各類初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析及作圖

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，用Origin Pro 9.0軟件制圖。通過(guò) Multi Experiment Viewer software v.4.8對(duì)初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行層次聚類分析（Hierarchical clustering analysis）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)不同品系高羊茅草坪目測(cè)質(zhì)量和葉綠素含量的影響

熱處理之前，熱敏感型高羊茅PI 234881的草坪質(zhì)量要優(yōu)于耐熱型高羊茅PI 578718。高溫脅迫下熱敏感基因型高羊茅的草坪質(zhì)量呈顯著下降趨勢(shì)，而耐熱基因型只有在脅迫21d后才顯著下降。在整個(gè)高溫脅迫期間，熱敏感型高羊茅的草坪質(zhì)量均顯著低于耐熱型高羊茅的草坪質(zhì)量（圖1）。

高溫導(dǎo)致高羊茅體內(nèi)葉綠素含量降低（圖2）。熱處理之前，熱敏感型高羊茅的葉綠素含量要顯著高于耐熱型高羊茅的葉綠素含量。隨著高溫脅迫的進(jìn)行，熱敏感型高羊茅的葉綠素含量迅速下降，而耐熱型高羊茅的葉綠素含量前期變化不大，直到21d時(shí)才顯著降低。因此，在高溫處理14和21d時(shí)，熱敏感型高羊茅的葉綠素含量要顯著低于耐熱型高羊茅的葉綠素含量。

2.2 高溫脅迫對(duì)不同品系高羊茅葉片相對(duì)含水量和葉片電解質(zhì)滲漏的影響

熱處理之前，兩個(gè)高羊茅品種葉片相對(duì)含水量差異不大，接近90%（圖3）。隨著高溫脅迫的進(jìn)行，高羊茅葉片相對(duì)含水量降低，尤其是熱敏感的高羊茅品種，在高溫脅迫下，葉片相對(duì)含水量急劇下降，熱脅迫21d時(shí)，其葉片相對(duì)含水量?jī)H為55%，顯著低于耐熱型高羊茅的葉片相對(duì)含水量。

圖1 高溫脅迫0，2，6，14和21d對(duì)不同品系高羊茅草坪質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of heat stress on turf quality in two tall fescue genotypes at 0，2，6，14and 21days after treatment

圖2 高溫脅迫0，2，6，14和21d對(duì)不同品系高羊茅葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of heat stress on Chl content in two tall fescue genotypes at 0，2，6，14and 21days after treatment

圖3 高溫脅迫0，2，6，14和21d對(duì)不同品系高羊茅葉片相對(duì)含水量的影響Fig.3 Effects of heat stress on relative leaf water content in two tall fescue genotypes at 0，2，6，14 and 21days after treatment

圖4 高溫脅迫0，2，6，14和21d對(duì)不同品系高羊茅葉片電解質(zhì)滲漏的影響Fig.4 Effects of heat stress on leaf electrolyte leakage in two tall fescue genotypes at 0，2，6，14 and 21days after treatment

圖5 高溫脅迫0，6和21d對(duì)不同品系高羊茅根系活力的影響Fig.5 Effects of heat stress on turf quality in two tall fescue genotypes at 0，6and 21dafter treatment

熱處理之前，熱敏感型高羊茅葉片的相對(duì)電解質(zhì)滲漏顯著高于耐熱型高羊茅葉片的相對(duì)電解質(zhì)滲漏。隨著高溫脅迫的進(jìn)行，雖然前兩天熱敏感高羊茅葉片的相對(duì)電解質(zhì)滲漏相比熱處理前沒(méi)有顯著性差異，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，熱敏感高羊茅葉片的相對(duì)電解質(zhì)滲漏加劇，到21d時(shí)，熱敏感高羊茅葉片的相對(duì)電解質(zhì)滲漏高達(dá)47.2%，顯著高于熱敏感高羊茅葉片的相對(duì)電解質(zhì)滲漏（圖4）。

2.3 高溫對(duì)不同品系高羊茅根系活力的影響

高溫導(dǎo)致高羊茅根系活力降低（圖5）。熱處理之前，耐熱型高羊茅的根系活力高達(dá)607.6μg／（g·h），要顯著高于熱敏感型高羊茅的根系活力。隨著高溫脅迫的進(jìn)行，熱敏感型高羊茅的根系活力迅速下降，而耐熱型高羊茅的根系活力前期沒(méi)有顯著性差異，直到21 d時(shí)才顯著降低。因此，在高溫處理21d時(shí)，熱敏感型高羊茅的根系活力僅為261.5μg／（g·h），要顯著低于耐熱型高羊茅的根系活力。

2.4 高溫對(duì)高羊茅初級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用化學(xué)工作站（Agilent MSD Productivity Chemstation），通過(guò)比對(duì)出峰時(shí)間和荷質(zhì)比分別檢測(cè)鑒定出包括游離氨基酸、糖類、有機(jī)酸、糖苷和糖醇在內(nèi)的25種代謝產(chǎn)物（表1）。將鑒定出的25種代謝產(chǎn)物進(jìn)行Hierarchical clustering層次聚類分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，高溫導(dǎo)致高羊茅體內(nèi)代謝產(chǎn)物大量積累，其中氨基酸（如脯氨酸、纈氨酸、谷氨酸）和糖類（如葡萄糖、蔗糖）在兩個(gè)品系高羊茅葉片中大量積累，而有機(jī)酸和脂肪酸類（如檸檬酸、棕櫚酸）在高羊茅根系中大量積累。兩個(gè)不同品系高羊茅葉片和根系中的25種代謝產(chǎn)物的變化情況，其中有7種代謝產(chǎn)物含量變化非常明顯，這7種代謝產(chǎn)物將會(huì)在接下來(lái)結(jié)果和討論部分重點(diǎn)分析（表2和表3）。

表1 高溫脅迫0，2，6，14和21d高羊茅葉片和根系中鑒定的25種代謝產(chǎn)物Table 1 List of 25metabolites identified in leaves and roots of tall fescue exposed to heat stress at 0，2，6，14and 21days

圖6 不同品系高羊茅葉片和根系應(yīng)答高溫脅迫的代謝產(chǎn)物變化的層次聚類分析Fig.6 Hierarchical clustering analysis of metabolites in samples obtained from leaves and roots of tolerant tall fescue genotype（T）and sensitive tall fescue genotype（S）

表2 高溫脅迫0，2，6，14和21d，不同品系高羊茅葉片中25種代謝產(chǎn)物變化情況Table 2 Change of 25metabolites identified in leaves of two tall fescue genotypes exposed to heat stress at 0，2，6，14and 21days

在輕度高溫脅迫（6d）、中度高溫脅迫（14d）和嚴(yán)重高溫脅迫（21d）條件下，耐熱型高羊茅PI 578718葉片和根系中檸檬酸的積累均顯著高于其在熱敏感型高羊茅PI 234881中的積累（圖7）；纈氨酸的積累在高羊茅2個(gè)基因型的葉片中先上升后下降，在根系中，纈氨酸的積累顯著上升，嚴(yán)重高溫脅迫（21d）條件下，耐熱型高羊茅PI 578718中纈氨酸的積累要顯著高于在熱敏感型高羊茅PI 234881中的（圖8）；谷氨酸的積累在高溫處理第6天的高羊茅2個(gè)基因型葉片中均出現(xiàn)顯著增加，但在重度脅迫（21d）下，熱敏感型高羊茅PI 234881葉片中谷氨酸含量下降，而耐熱型高羊茅PI 578718葉片中谷氨酸積累上升，同時(shí)谷氨酸含量在高羊茅2個(gè)基因型根系中含量均上升，而且在耐熱型高羊茅PI 578718中上升更明顯（圖8）；脯氨酸含量在高溫處理第2，6，14天的熱敏感型高羊茅PI 234881中與高溫處理第2，6，21天的耐熱型高羊茅PI 578718中均顯著升高（圖8）；蔗糖和肌醇的積累在高羊茅2個(gè)基因型葉片與根系中均顯著升高，而且在長(zhǎng)期高溫脅迫條件下（21d），耐熱型高羊茅PI 578718葉片和根系中的蔗糖和肌醇含量均要顯著高于熱敏感型高羊茅PI 234881中的（圖9）；棕櫚酸在高羊茅2個(gè)基因型的葉片與根系中被檢測(cè)到，與耐熱型高羊茅PI 578718相比，高溫處理前，熱敏感型高羊茅PI 234881葉片和根系中含有更高水平的棕櫚酸，重度高溫脅迫下，熱敏感型高羊茅PI 234881和片和根系中棕櫚酸含量下降，而耐熱型高羊茅PI 578718葉片和根系中棕櫚酸含量上升（圖10）。

表3 高溫脅迫0，6和21d，不同品系高羊茅根系中25種代謝產(chǎn)物變化情況Table 3 Change of 25metabolites identified in roots of two tall fescue genotypes exposed to heat stress at 0，6and 21days

圖7 高溫脅迫對(duì)不同品系高羊茅葉片（0，2，6，14和21d）和根系（0，6和21d）中檸檬酸的影響Fig.7 Citric acid identified in leaves and roots of two tall fescue genotypes exposed to heat stress at 0，2，6，14，21days and 0，6，21days

圖8 高溫脅迫對(duì)不同品系高羊茅葉片（0，2，6，14和21d）和根系（0，6和21d）中谷氨酸、纈氨酸和脯氨酸的影響Fig.8 Proline，valine and glutamic acid identified in leaves and roots of two tall fescue genotypes exposed to heat stress at 0，2，6，14，21days and 0，6，21days

圖9 高溫脅迫對(duì)不同品系高羊茅葉片（0，2，6，14和21d）和根系（0，6和21d）中蔗糖和肌醇的影響Fig.9 Sucrose and inositol identified in leaves and roots of two tall fescue genotypes exposed to heat stress at 0，2，6，14，21days and 0，6，21days

圖10 高溫脅迫對(duì)不同品系高羊茅葉片（0，2，6，14和21d）和根系（0，6和21d）中棕櫚酸的影響Fig.10 Hexadecanoic acid identified in leaves and roots of two tall fescue genotypes exposed to heat stress at 0，2，6，14，21days and 0，6，21days

3 討論

3.1 高溫對(duì)高羊茅外觀形態(tài)及生理的影響

草坪質(zhì)量是草坪在其生長(zhǎng)和使用期內(nèi)葉片色澤、質(zhì)地、均一性等表型的綜合體現(xiàn)［20］。冷季型草坪草對(duì)高溫敏感，在夏季草坪休眠或者死亡，草坪會(huì)發(fā)生枯黃，從而降低草坪的觀賞性［21－22］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高溫降低了高羊茅的草坪質(zhì)量，相比耐熱性高羊茅，熱敏感型高羊茅的草坪質(zhì)量下降得更明顯。

葉綠素反映葉片光合能力的強(qiáng)弱；植物葉片相對(duì)含水量的大小，可以部分反映植物抗逆性的能力；膜的功用保持不變是維持光合作用和呼吸作用的關(guān)鍵［15－16］。葉片相對(duì)電解質(zhì)滲漏能夠指示葉片膜結(jié)構(gòu)破壞程度，葉片相對(duì)電解質(zhì)滲漏的大小，可以作為判斷植物耐熱性水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［23－24］。高溫處理下，葉片電解質(zhì)滲漏加劇，可見(jiàn)持續(xù)高溫對(duì)高羊茅葉片膜結(jié)構(gòu)造成了破壞，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)損傷，電解質(zhì)滲漏加劇。熱敏感型高羊茅植株失水嚴(yán)重，植物葉片含水量的變化一定程度上反映了植株的保水能力和抗逆能力，含水量變化越小，其保水能力和抗逆性就越強(qiáng)［16，24］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，在高溫脅迫下，熱敏感型高羊茅品種葉綠素含量和葉片相對(duì)含水量顯著下降，葉片電解質(zhì)滲漏明顯加劇均表明其對(duì)高溫變化更加敏感。

根系活力反映根系吸收能力的強(qiáng)弱，根系活力強(qiáng)，根系吸水和吸收礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的水平也高，植物抗逆能力也強(qiáng)［25］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫導(dǎo)致高羊茅根系褐變，活力下降，相比耐熱型高羊茅，熱敏感高羊茅的根系活力下降得更明顯。

高溫脅迫雖然引起了高羊茅2個(gè)基因型草坪質(zhì)量、葉片RWC、葉綠素含量以及根系活力的降低，葉片EL的升高，但耐熱型高羊茅PI 578718較熱敏感型高羊茅PI 234881能保持相對(duì)高水平的葉片水分狀態(tài)、光合能力以及更穩(wěn)定的膜系統(tǒng)，尤其在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)期高溫處理以后，該研究結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的高羊茅耐高溫篩選結(jié)果相一致，即在相同高溫條件下，耐熱型高羊茅PI 578718比熱敏感型高羊茅PI 234881具有更強(qiáng)的耐熱能力。而高溫脅迫給高羊茅造成的傷害程度以及基因型間耐受高溫脅迫的差異，可能與代謝產(chǎn)物的不同積累密切相關(guān)，下面將詳細(xì)進(jìn)行討論。

3.2 高溫對(duì)高羊茅代謝產(chǎn)物的影響

3.2.1 對(duì)有機(jī)酸的影響 在高羊茅2個(gè)基因型的葉片或根系中，共檢測(cè)出包括丁酸、丁二酸和檸檬酸等共5種有機(jī)酸，其中檸檬酸是參與呼吸作用過(guò)程中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。本試驗(yàn)中，高溫脅迫下，高羊茅葉片和根系中檸檬酸含量顯著上升，而且耐熱型高羊茅葉片和根系中的檸檬酸含量均顯著高于其在熱敏感型高羊茅中的（圖7），而且在嚴(yán)重高溫脅迫（21d）下，耐熱型高羊茅葉片和根系中檸檬酸含量分別是熱敏感高羊茅的1.8和3.2倍。研究表明，檸檬酸在植物體內(nèi)是通過(guò)丙酮酸脫羧后形成的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成6C的檸檬酸［26］。而且以往的研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸合成酶受高溫的影響，植物可以通過(guò)緩解檸檬酸合成酶的熱變性，并促進(jìn)熱變性的檸檬酸合成酶復(fù)性來(lái)抵御高溫脅迫，高溫下植物通過(guò)對(duì)檸檬酸合成酶的有效保護(hù)，不但可以增加線粒體的耐熱性，而且可以提高植物的抗熱能力［27］。但是目前，有關(guān)檸檬酸與耐熱性之間的聯(lián)系尚未明確。

3.2.2 對(duì)氨基酸的影響 氨基酸在植物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中具有十分重要的作用。氨基酸不僅能夠合成蛋白質(zhì)，而且還是許多植物應(yīng)答非生物脅迫相關(guān)代謝產(chǎn)物的前體［28］。本研究中，纈氨酸含量在高羊茅2個(gè)基因型的葉片中先上升后下降，在根系中，其含量顯著上升，而且耐熱型高羊茅PI 578718中纈氨酸含量要顯著高于在熱敏感型高羊茅PI 234881中的（圖8）。纈氨酸受脅迫后表達(dá)量的升高在許多逆境條件下均有報(bào)道［10，29］。在本研究中，纈氨酸含量在耐熱型高羊茅PI 578718根系中的升高，可能作為初生代謝物而產(chǎn)生更多的次生代謝物，以保護(hù)植物組織免受由高溫脅迫所引發(fā)的傷害。

通常非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，促使中間銨的積累［30］。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，不同形式或者不同亞型的谷氨酸，常作為逆境響應(yīng)物質(zhì)在受到不同脅迫環(huán)境的植物體中積累［31］。在本研究中，谷氨酸含量在高羊茅2個(gè)基因型根系中含量均明顯增加，尤其是在耐熱型高羊茅體內(nèi)（圖8），以往的研究表明，谷氨酸作為代謝途徑中重要的中間物，在植物代謝過(guò)程起到了非常重要的作用［31］，這也說(shuō)明谷氨酸含量的維持和積累有助于高羊茅更好地適應(yīng)和耐受高溫脅迫。

與氨基酸不同，脯氨酸則是一種非蛋白且與脅迫相關(guān)的氨基酸［32］。脯氨酸作為能量庫(kù)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑、滲透調(diào)節(jié)劑、自由基清除劑以及脅迫信號(hào)分子，在植物的防御系統(tǒng)中扮演了諸多角色［33］。在高溫脅迫的初期（6 d），脯氨酸在熱敏感型高羊茅PI 234881葉片中的迅速積累，表明在輕度高溫脅迫下脯氨酸可能作為一種脅迫信號(hào)分子而起作用。在高溫處理第14天時(shí)，熱敏感型高羊茅PI 234881葉片中的脯氨酸含量顯著高于耐熱型高羊茅PI 578718中的，而在高溫處理第21天時(shí)，耐熱型高羊茅PI 578718葉片中的脯氨酸含量顯著高于熱敏感型高羊茅PI 234881中的，這表明脯氨酸在重度高溫條件下的積累，可能是高羊茅（尤其是耐熱基因型）適應(yīng)高溫脅迫的一種響應(yīng)。

3.2.3 對(duì)糖與糖醇的影響 在植物體中，逆境環(huán)境下經(jīng)常會(huì)誘導(dǎo)各種糖類和糖醇等相容性物質(zhì)產(chǎn)生積累［32］。這些低分子量的有機(jī)化合物，在環(huán)境刺激下出現(xiàn)積累，具有滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞功能保護(hù)、細(xì)胞組分完整性的維持等功能［10，33］。高溫脅迫初期，植物葉片的相對(duì)含水量仍然較高，一些糖類和糖醇類物質(zhì)的積累有助于細(xì)胞維持滲透勢(shì)，以限制或減少植物水分的散失［34－35］。許多糖類，如果糖、半乳糖、葡萄糖、核糖以及蔗糖，均可作為高溫條件下起滲透調(diào)節(jié)作用［10，36］。尤其是蔗糖，已證明在劇烈的脫水和熱脅迫結(jié)合處理的擬南芥中，蔗糖將會(huì)取代脯氨酸作為主要的滲透保護(hù)劑［11］。除了作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、脅迫誘導(dǎo)代謝產(chǎn)物改變的底物或者信號(hào)分子以外，蔗糖在一系列被測(cè)試的小分子糖中具有最強(qiáng)的抗氧化能力，同時(shí)也在植物呼吸代謝，能量供應(yīng)過(guò)程中起到了非常重要的作用［37－39］。糖醇是水化的碳水化合物，通過(guò)似水的羥基基團(tuán)，能夠在大分子周圍形成水化層［40］。糖醇不僅與碳的轉(zhuǎn)運(yùn)與貯存、超低溫保護(hù)、硼的運(yùn)輸與能量傳遞緊密相關(guān)；更重要的是，它還參與逆境條件下植物滲透調(diào)節(jié)與活性氧的抑制［41］。肌醇是棉籽糖與水蘇糖的前體，在植物中它們常作為滲透調(diào)節(jié)劑或者自由基的有效清除劑來(lái)提高植物的抗逆性［42］。在本研究中，蔗糖和肌醇的含量在高羊茅2個(gè)基因型葉片與根系中均顯著升高，而且在長(zhǎng)期高溫脅迫條件下（21d），耐熱型高羊茅PI 578718葉片和根系中的蔗糖和肌醇含量均要顯著高于熱敏感型高羊茅PI 234881中的（圖9），耐熱型高羊茅PI 578718可能正是通過(guò)借助蔗糖和肌醇更強(qiáng)的抗氧化能力和滲透保護(hù)能力來(lái)提高其耐熱水平。

3.2.4 對(duì)脂肪酸的影響 研究表明，脂質(zhì)的組成及飽和程度與植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力關(guān)系密切［43－44］。亞油酸，亞麻酸和棕櫚酸是主要的質(zhì)膜脂質(zhì)成分。植物體內(nèi)高水平的脂肪酸含量，尤其是不飽和脂肪酸的含量，能夠維持逆境脅迫下植物細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層更好的流動(dòng)性［45－46］。在本研究中，高溫處理前，相比耐熱性高羊茅，熱敏感型高羊茅PI 234881葉片和根系中含有更高水平的棕櫚酸（圖10）。高溫脅迫下，熱敏感型高羊茅PI 234881葉片和根系中棕櫚酸含量下降，而耐熱型高羊茅PI 578718葉片和根系中棕櫚酸含量上升。這表明，高羊茅葉片和根系中棕櫚酸含量上升有助于提高其耐熱性，作為飽和脂肪酸，棕櫚酸可能確保細(xì)胞膜質(zhì)具有一定的流動(dòng)性后，通過(guò)維持細(xì)胞膜更好的穩(wěn)定性來(lái)提高高羊茅對(duì)高溫的耐受能力。

總之，通過(guò)高羊茅2個(gè)基因型對(duì)高溫脅迫的生理響應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)在相同高溫條件下耐熱型高羊茅PI 578718比熱敏感型高羊茅PI 234881更耐熱。在受高溫脅迫的高羊茅2個(gè)基因型葉片或者根系中，GC－MS分析鑒定出25種代謝產(chǎn)物，包括9種有機(jī)酸與脂肪酸、9種氨基酸、7種糖與糖醇。受高溫脅迫的葉片中某些代謝產(chǎn)物表達(dá)量的升高或者維持，可能是耐熱型高羊茅PI 578718與熱敏感型高羊茅PI 234881之間存在耐熱性差異的主要原因。在中度和／或重度高溫脅迫下（14，21d），耐熱型高羊茅PI 578718葉片中谷氨酸、脯氨酸、蔗糖、肌醇、棕櫚酸等代謝產(chǎn)物的更多積累，使其比熱敏感型高羊茅PI 234881更耐熱。在重度高溫脅迫下（21d），耐熱型高羊茅PI 578718根系中纈氨酸、谷氨酸、脯氨酸、蔗糖、肌醇、棕櫚酸等代謝產(chǎn)物更高水平的積累，使其比熱敏感型高羊茅PI 234881具有更好地耐受高溫脅迫的能力。而且本研究結(jié)果表明，檸檬酸作為抗氧化劑并參與呼吸作用三羧酸循環(huán)途徑，它的高水平積累，可能更有助于提高高羊茅對(duì)高溫脅迫的耐性和適應(yīng)性。

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