劉宏程, 李 寧,2, 林 濤, 邵金良, 黎其萬*

(1. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(昆明), 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 云南 昆明 650223; 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 云南 昆明 650500)

研究論文

基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定牛奶中9種類固醇激素殘留

劉宏程1, 李 寧1,2, 林 濤1, 邵金良1, 黎其萬1*

(1. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(昆明), 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 云南 昆明 650223; 2. 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 云南 昆明 650500)

利用基質(zhì)固相分散技術(shù)(MSPD),建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器(MSD)同時(shí)分析牛奶中9種類固醇激素殘留的方法。便攜式MSD的靈敏度和準(zhǔn)確度優(yōu)于紫外檢測器;相比傳統(tǒng)的質(zhì)譜儀,MSD不需質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化,操作簡便,開機(jī)抽真空時(shí)間短(只要5 min),即開即用。分別考察了流動相比例、萃取溶劑和固相萃取小柱凈化對MSD靈敏度和牛奶樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明,MSD正離子模式對吸電子基團(tuán)化合物的靈敏度更高,受外界條件影響大。經(jīng)MSPD凈化后,9種類固醇激素的基質(zhì)效應(yīng)由84%～160%降低為80%～121%。方法學(xué)研究結(jié)果表明,9種類固醇激素的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為0.87%～1.78%和1.82%～3.79%,加標(biāo)回收率為68.7%～94.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%,方法檢出限(LOD)為0.5～10 μg/kg,定量限(LOQ)為2～20 μg/kg。該方法適合日常大批量樣品的檢測。

基質(zhì)固相分散;超高效液相色譜;質(zhì)譜檢測器;類固醇激素;牛奶

天然類固醇激素主要由動物的雌性、雄性性器官和腎上腺素器官產(chǎn)生,是動物生長發(fā)育的重要物質(zhì)之一。人工合成很多類似結(jié)構(gòu)的類固醇激素,主要有雄性激素(如睪酮)、雌性激素(如苯甲酸雌二醇)和促孕激素(如孕酮),為了治療器官病變產(chǎn)生的疾病或促進(jìn)生長、發(fā)育,需要注射人工合成激素,這些激素在動物體內(nèi)很難分解,通過食物鏈進(jìn)入人體后,可擾亂人體內(nèi)分泌系統(tǒng),導(dǎo)致男性女性化、男性生育能力下降、女性乳腺癌和卵巢癌、女性性早熟等[1,2]。農(nóng)業(yè)部235號公告明確規(guī)定醋酸甲羥孕酮、甲基睪丸酮等為禁用獸藥;苯甲酸雌二醇、丙酸睪酮為治療允許藥物,但不得在牛奶中檢出。國際法典委員會(CAC)對醋酸甲羥孕酮在動物肝臟中的最大殘留限量設(shè)定為10 μg/kg,對牛奶中睪酮、孕酮的最大殘留限量未做限制。因此快速準(zhǔn)確檢測牛奶中這些類固醇激素對于保障牛奶的質(zhì)量安全具有重要意義。

類固醇激素藥物殘留的相關(guān)檢測方法已有很多報(bào)道[3],主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[4,5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6-8]、液相色譜法(HPLC)[9,10]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11,12]等。ELISA因其高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用于大量樣品的篩查,但方法假陽性率高,只能作為定性初篩。類固醇激素為非揮發(fā)性物質(zhì),需要進(jìn)行硅烷甲基化[13,14]或者乙酰化反應(yīng)[15]轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性成分才能進(jìn)行GC-MS測定,操作復(fù)雜、耗時(shí)長。HPLC由于受檢測器靈敏度的限制,檢出限只能達(dá)到1～0.5 mg/kg[10]。LC-MS/MS是類固醇激素藥物殘留檢測的常用技術(shù)之一,靈敏度高,但是儀器昂貴,基質(zhì)效應(yīng)明顯[16,17]。這些方法多關(guān)注牛奶中睪酮、孕酮、甲基睪酮?dú)埩舻臏y定,關(guān)于丙酸睪酮、雙氫睪酮的多殘留檢測方法報(bào)道較少。

超高效液相色譜(UPLC)作為一種新的色譜方法,涵蓋了小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速數(shù)據(jù)收集等全新技術(shù),具有柱效高、分離時(shí)間短、溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)[18-20]。目前UPLC系統(tǒng)帶有一款便攜式質(zhì)譜檢測器(MSD),靈敏度和準(zhǔn)確度優(yōu)于紫外檢測器(PDA),擺脫了常規(guī)質(zhì)譜儀的條件優(yōu)化,操作簡便,開機(jī)抽真空時(shí)間短(只要5 min),即開即用,適合日常大批量樣品的檢測。

本研究采用基質(zhì)固相分散技術(shù)凈化,建立了UPLC-MSD同時(shí)測定9種類固醇激素殘留的高靈敏度方法。分別考察了流動相比例、萃取溶劑和基質(zhì)固相分散材料對MSD靈敏度和對牛奶樣品的基質(zhì)效應(yīng)的影響,提供了降低基質(zhì)效應(yīng)的有效方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(Waters公司,ACQUITY UPLC H class型),配置四元泵溶劑淋洗系統(tǒng)、自動進(jìn)樣系統(tǒng)和便攜式QDa質(zhì)譜檢測器。色譜柱BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司)。純水器(Sartorius公司,Arium 611DI型)。C18填料(50 g, Supelco公司), Oasis HLB填料(10 g, Waters公司),帶真空泵的12位固相萃取裝置(Supelco公司)。

雙烯雌酚(dienestrol,DE,純度97.5%)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate,MPA,純度98.5%)、甲基睪丸酮(methyltestosterone,MT,純度99.8%)、苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB,純度99.5%)、丙酸睪酮(testosterone propionate,TP,純度98.5%)、孕酮(progesterone,PT,純度97.5%)、睪酮(testosterone,T,純度98.5%)、雙氫睪酮(androstan-17-ol-3-one,AT,純度99.8%),左炔諾孕酮(levonorgestrol,LG,純度98.5%)均購于德國Dr. Ehrenstorfer公司,結(jié)構(gòu)式見圖1。

乙腈、甲醇均為色譜純(Merck公司),乙酸銨、甲酸為優(yōu)級純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其余試劑為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品制備

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

除苯甲酸雌二醇用丙酮溶解外,其他標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇溶解,配制成500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冰箱中保存。

分別用甲醇逐級稀釋,配制5個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100 μg/L(其中AT和DE的質(zhì)量濃度高10倍,為50、100、200、500、1 000 μg/L)。

圖1 9種類固醇激素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the nine estrogenic steroids

1.2.2樣品制備

準(zhǔn)確量取5 mL牛奶樣品,加入10 mL甲酸-乙腈(5∶95, v/v)混合溶液,渦旋混勻,加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鈉,混勻,以5 000 r/min離心5 min;取5 mL上清液,氮?dú)獯抵?.5 mL,加0.5 g HLB填料,在通風(fēng)櫥中放置10 min,揮干有機(jī)相,充分研磨,均勻裝入底部墊上濾紙的10 mL注射器,上層再墊一片濾紙,并把填料輕輕壓緊。先用6 mL水沖洗,不收集;抽真空10 min,以去除柱中殘留水分。最后以2 mL甲醇洗脫3次,收集洗脫液,室溫下氮吹至近干,用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(2∶8, v/v)定容至1 mL,混勻,經(jīng)0.2 μm有機(jī)相濾膜過濾,上機(jī)分析。

1.3 色譜條件

BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣量4 μL;流動相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.05 g/L乙酸銨)(A)-乙腈(B)(80∶20, v/v),流動相梯度:0～3 min, 80%A～40%A(保持1 min); 4～5 min, 40%A～20%A(保持1 min); 6 min回到初始狀態(tài)。流速0.3 mL/min; MSD掃描方式:正、負(fù)離子同時(shí)掃描;掃描質(zhì)量數(shù)范圍:m/z30～400;毛細(xì)管電壓:0.8 kV; Selected ion recording (SIR)掃描模式,錐孔電壓15 V,采樣速率8點(diǎn)/s。定量離子和保留時(shí)間如表1。

表1 9種類固醇激素的定量離子和保留時(shí)間

2 結(jié)果與討論

2.1 MSD性能和色譜條件的優(yōu)化

由于MSD為便攜式質(zhì)譜儀,簡化了傳統(tǒng)質(zhì)譜儀需要標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行優(yōu)化質(zhì)譜電壓的繁瑣操作,通過全掃描模式(正/負(fù)離子)可確定目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和監(jiān)測離子,這些化合物均在正離子模式下出峰,其定量離子見表1。

對色譜分離條件和MSD性能進(jìn)行考察。按照1.3節(jié)色譜條件對100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離,SIR模式檢測。當(dāng)流動相A相選擇為水時(shí),只有PT、T、TP、MPT、LG和MT等6個(gè)化合物出峰。A相為氨水(0.05%, pH=9)時(shí),與水為流動相的結(jié)果一致。當(dāng)選擇酸(0.1%(v/v)甲酸水溶液,含0.05 g/L乙酸銨)為流動相時(shí),才能保證9個(gè)化合物同時(shí)出峰。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),流動相比例對PT、T、TP、MPT、LG和MT等6個(gè)化合物的峰響應(yīng)影響大,這6個(gè)化合物在A相/B相(80/20, v/v)條件下的相應(yīng)比A相/B相(40/60, v/v)條件下峰高響應(yīng)高10倍,但對AT、EB和DE這3個(gè)化合物的峰高響應(yīng)沒有影響。有機(jī)相使用乙腈比使用甲醇時(shí)目標(biāo)物的峰響應(yīng)高。從圖1可知,PT、T、TP、MPT、LG和MT等6個(gè)化合物均含有環(huán)己烯酮,在酸性條件下容易電離,AT為環(huán)己酮、EB和DE為酚酸,酸性條件不容易電離,因此MSD正離子模式對吸電子基團(tuán)化合物靈敏度更高,受流動相影響大。

由于流動相同時(shí)影響靈敏度和分離度,通過優(yōu)化條件,選擇A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.05 g/L乙酸銨), B相為乙腈,初始比例為80%A,梯度洗脫,6 min內(nèi)能完全分離9種類固醇激素,其中AT和DT、PT和MPA、LG和EB的保留時(shí)間相差0.036～0.075 min,分離度R分別為1.0、1.5、1.5,體現(xiàn)了UPLC的分離優(yōu)勢,相比文獻(xiàn)[16]采用LC-MS/MS的18 min分離條件,分離時(shí)間縮短為原來的1/3(見圖2)。

圖2 選擇離子檢測(SIR)掃描模式下類固醇激素 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of a standard mixture of the nine estrogenic steroids in selected ion recording (SIR) mode

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響

由于便攜式MSD為ESI電離模式,可能存在基質(zhì)效應(yīng)(離子增強(qiáng)或離子抑制)?；|(zhì)效應(yīng)(ME)可以表示為同一添加濃度的被分析物在基質(zhì)中的信號與分析物在有機(jī)溶劑中的信號比值,如公式(1):

ME=Am/Ao×100%

(1)

其中Am和Ao表示被分析物在基質(zhì)中和在有機(jī)溶劑中的峰面積,當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間表明基質(zhì)效應(yīng)可以忽略,但基質(zhì)效應(yīng)在50%～80%和120%～150%之間時(shí),需要考慮如何消除基質(zhì)效應(yīng)。

圖3 采用兩種溶劑萃取時(shí)類固醇激素的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of the estrogenic steroids with two extraction solvents

參照文獻(xiàn)選擇乙腈[16]和酸性乙腈[17]作為萃取溶劑,按照1.2.2節(jié)萃取方法對添加100 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的牛奶樣品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察,結(jié)果見圖3。從圖3可知,以乙腈或者甲酸-乙腈(5∶95, v/v)作萃取溶劑時(shí),T、TP和MT等3個(gè)化合物有明顯的基質(zhì)效應(yīng),但以甲酸-乙腈(5∶95, v/v)作萃取溶劑時(shí)其他化合物的基質(zhì)效應(yīng)低于乙腈作萃取溶劑,因此選擇甲酸-乙腈(5∶95, v/v)作為提取溶液。

2.3 基質(zhì)固相分散填料對樣品的凈化效果

MSPD的原理是將樣品和鍵合固定相載體混合研磨使樣品組織細(xì)胞碎裂,待測組分通過擴(kuò)散進(jìn)入鍵合的有機(jī)相,然后選擇合適洗脫強(qiáng)度的溶劑把待測組分洗脫出來。常用的鍵合固定相有C18等[21]。在牛奶中加入100 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)品,按照1.2.2節(jié)樣品處理,比較C18和HLB填料對牛奶的凈化效果和目標(biāo)化合物的回收率。由于HLB為N-乙烯吡咯烷酮和親脂性二乙烯基苯聚合而成,對親水親脂基質(zhì)有吸附,對牛奶樣品的凈化效果比親脂的C18性能好,從目標(biāo)化合物MT的色譜圖(m/z303,圖4)可看出,HLB對雜質(zhì)(4.892和5.187 min)的凈化效率比C18的高,圖5為加標(biāo)牛奶樣品的典型色譜圖,每個(gè)通道目標(biāo)化合物均能很好地定性定量。

圖4 兩種填料凈化后的加標(biāo)樣品色譜圖(m/z 303)Fig.4 Chromatograms of a spiked sample with two MSPD (m/z 303)

圖5 加標(biāo)牛奶樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of a spiked milk sample

通過HLB填料凈化后,9種類固醇激素的基質(zhì)效應(yīng)由84%～160%變?yōu)?0%～121%,基本消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,回收率可以達(dá)到75%～100%;但使用C18填料凈化,還是不能消除T、TP和MT的基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)確證

2.4.1定量標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

采用1.2.1節(jié)方法制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按優(yōu)化后的檢測條件進(jìn)樣,以各定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到9種化合物的線性方程及其相關(guān)系數(shù)。9種類固醇激素在5～100 μg/L(其中AT、DE和EB為50～1 000 μg/L)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其檢出限(LOD)(根據(jù)S/N=3計(jì)算)和方法的定量限(LOQ)(根據(jù)S/N=10計(jì)算)見表2。從表2可知,T、TP、PT這幾種化合物的靈敏度達(dá)到歐盟對牛奶中類固醇激素殘留限量要求和接近文獻(xiàn)[16]LC-MS/MS方法的靈敏度,AT、DE和EB的靈敏度比LC-MS/MS差很多。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限及定量限

Y: peak area, mV×s;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2日內(nèi)穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率試驗(yàn)

將100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在一天內(nèi)重復(fù)測定5次,計(jì)算每個(gè)目標(biāo)化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);在5天內(nèi)每天重復(fù)進(jìn)樣測定,計(jì)算每個(gè)目標(biāo)化合物峰面積的RSD,結(jié)果表明,9種類固醇激素的日內(nèi)精度和日間精密度分別為0.87%～1.78%和1.82%～3.79%,表明9種類固醇激素在常溫下是穩(wěn)定的。

選擇空白牛奶,分別添加5、50、100 μg/kg進(jìn)行回收率和重復(fù)性試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)5次測定。結(jié)果見表3。從表3可知,所有目標(biāo)化合物的回收率在68.7%～94.7%之間, RSD小于10%。

表3 方法的準(zhǔn)確度和精密度(n=5)

3 結(jié)論

本工作建立了基質(zhì)固相分散-UPLC-MSD同時(shí)測定牛奶中9種類固醇激素殘留量的方法,研究發(fā)現(xiàn)MSD對含有吸電子基團(tuán)的化合物靈敏度高,受流動相影響大,初始化流動相中酸比例高,峰響應(yīng)值高。對基質(zhì)固相填料的考察發(fā)現(xiàn),經(jīng)HLB填料凈化后,可有效降低基質(zhì)效應(yīng),而C18填料不能消除T、TP和MT等化合物的基質(zhì)效應(yīng)。

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2016年度《分析化學(xué)》雜志征訂啟事

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《分析化學(xué)》(ISSN 0253-3820, CODEN FHHHDT, CN 22-1125/O6)是中國科學(xué)院和中國化學(xué)會共同主辦的專業(yè)性學(xué)術(shù)期刊,主要報(bào)道我國分析化學(xué)創(chuàng)新性研究成果,反映國內(nèi)外分析化學(xué)學(xué)科前沿和進(jìn)展?？镌O(shè)有特約來稿、研究快報(bào)、研究報(bào)告、研究簡報(bào)、評述與進(jìn)展、儀器裝置與實(shí)驗(yàn)技術(shù)、來稿摘登等欄目。讀者對象為從事分析化學(xué)研究和測試的科技人員及大專院校師生。本刊也是有關(guān)圖書、情報(bào)等部門必不可少的信息來源。

《分析化學(xué)》目前是我國自然科學(xué)核心期刊及全國優(yōu)秀科技期刊,1999年榮獲首屆國家期刊獎(jiǎng),2000年獲中國科學(xué)院優(yōu)秀期刊特別獎(jiǎng),2001年入選“中國期刊方陣”高知名度、高學(xué)術(shù)水平的“雙高”期刊,2002年又榮獲第二屆國家期刊獎(jiǎng)和第三屆中國科協(xié)優(yōu)秀科技期刊獎(jiǎng)。論文已被包括美、英、日、俄的國內(nèi)外近20種檢索系統(tǒng)收錄。根據(jù)中國科技信息研究所歷年來發(fā)布的“中國科技期刊引證報(bào)告”獲悉,2014年公布的影響因子為1.263。多年來,本刊逐年被選入美國權(quán)威文摘《化學(xué)文摘》(CA)摘引量最大的1000種期刊(簡稱“CA千種表”)中,并居我國入選“CA千種表”期刊的前列。從1999年第27卷第1期開始被美國科學(xué)信息研究所(Institute for Scientific Information)正式收入《科學(xué)引文索引擴(kuò)大版》(Science Citation Index-Expanded, SCIE, also known as SciSearch),同時(shí)還被收入《Research Alert》和《Chemistry Citation Index》等ISI系列。近期公布的2014年SCI影響因子為0.754。

本刊為月刊,每期160頁(大16開),由科學(xué)出版社出版。國內(nèi)單價(jià)45.00元,全年540.00元。郵發(fā)代號12-6,全國各地郵局訂閱,國外代號M336,中國國際書店訂購,漏訂讀者,可與編輯部聯(lián)系。廣告經(jīng)營許可證號:2200004000094,廣告代理:北京行勝言廣告有限公司,電話:010-51289220。

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分析化學(xué)編輯部 供稿

Determination of nine estrogenic steroids in milk using matrix solid phase dispersion-ultra performance liquid chromatography with mass spectrometric detector

(1.DivisionofChemicalMetrologyandAnalyticalScience,NationalInstituteofMetrology,Beijing100029,China; 2.PolytechInstrument,Beijing100095,China)

LIU Hongcheng1, LI Ning1,2, LIN Tao1, SHAO Jinliang1, LI Qiwan1*

(1.LaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforAgro-Product(Kunming),MinistryofAgriculture,QualityStandardandTestingTechnologyInstituteofYunnanAcademyofAgricultureScience,Kunming650223,China; 2.DepartmentofPharmaceuticalScience,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China)

An analytical method for the multiresidue determination of nine estrogenic steroids in milk was developed by modified matrix solid phase dispersion (MSPD) purification and ultra performance liquid chromatography (UPLC) with mass spectrometric detector (MSD). The sensitivity and accuracy of MSD were better than that of ultraviolet detector. In comparison with traditional mass spectrometry, the merits of MSD were simpler in operation and shorter in starting time (5 min). The results showed that the limits of detection of the compounds with nucleophilic substitution were high in positive ion mode of MSD and were easily affected by environmental conditions. The matrix effects of milk samples reduced from 84%-160% to 80%-121% after MSPD purification. The intraday precision and interday precision of the nine estrogenic steroids were 0.87%-1.78% and 1.82%-3.79%, respectively. The average recoveries were 68.7%-94.7%, and the relative standard deviations (RSDs) were less than 10%. The limits of detection (LODs) were 0.5-10 μg/kg. The limits of quantification (LOQ) were 2-20 μg/kg.

matrix solid phase dispersion (MSPD); ultra performance liquid chromatography (UPLC); mass spectrometric detector (MSD); estrogenic steroids; milk

10.3724/SP.J.1123.2015.06035

云南省科技惠民計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013RA012);科技創(chuàng)新平臺建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2014DA001).

2015-06-23

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1163-06

*通訊聯(lián)系人.E-mail:cmliu_0@sina.com.