范婷婷,唐良萏

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院婦科，重慶合川 401520；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

沉默Nek2基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞周期的影響

范婷婷1,唐良萏2△

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院婦科，重慶合川 401520；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016)

目的 研究RNA干擾NIMA相關(guān)激酶2(Nek2)表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞周期的影響及其相關(guān)的分子機(jī)制。方法將針對(duì)Nek2基因的siRNA轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞周期變化，并用Western blot技術(shù)檢測(cè)Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染入卵巢癌SKOV3細(xì)胞48 h后，與細(xì)胞周期相關(guān)的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表達(dá)水平以及ERK1/2磷酸化水平的變化。結(jié)果空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和RNA干擾組中處于G2/M期的細(xì)胞比例分別為13.72%、12.27%和1.56%，與兩對(duì)照組比較，處于G2/M期的干擾組細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。Nek2基因沉默后，與兩對(duì)照組比較，SKOV3細(xì)胞內(nèi)cyclinB1和CDK1的蛋白表達(dá)水平明顯下降，P27的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，SKOV3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平明顯下降(P<0.05)。結(jié)論沉默Nek2基因，可阻止卵巢癌SKOV3細(xì)胞啟動(dòng)有絲分裂，從而抑制其增殖。

RNA干擾；卵巢腫瘤；細(xì)胞周期；NIMA相關(guān)激酶

近年來(lái)，抗體芯片技術(shù)為腫瘤的早期診斷、腫瘤標(biāo)志物的篩選鑒定以及藥物治療等方面提供了新的研究平臺(tái)，尤其在對(duì)腫瘤標(biāo)志物的篩選和鑒定中運(yùn)用最為廣泛。在前期實(shí)驗(yàn)中，本課題組通過(guò)反向捕獲抗體芯片技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)NIMA相關(guān)激酶2(NIMA-related kinase2,Nek2)在卵巢癌中高表達(dá)，且NEK2-siRNA能有效抑制SKOV3細(xì)胞中Nek2的表達(dá)。由于Nek2是細(xì)胞周期Nek家族成員之一，在細(xì)胞周期中，其表達(dá)及活性高度保守。因此，本實(shí)驗(yàn)將利用NEK2-siRNA進(jìn)一步研究Nek2基因與卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所饋贈(zèng)。Nek2、P27、cyclinB1、CDK1一抗均購(gòu)自Abcam公司。Trizol、Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。根據(jù)Nek2基因序列，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成Nek2-siRNA序列，上游引物：5′-GGC ACA CCU UAU UAC AUG UTT-3′，下游引物：5′-ACA UGU AAU AAG GUG UGC CTT-3′。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 (1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：在37 ℃、5%CO2飽和濕度的條件下，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞。用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按30%～50%密度接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染過(guò)程：首先制備siRNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，于室溫放置20 min；然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察轉(zhuǎn)染情況。(2)細(xì)胞分組：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，轉(zhuǎn)染Nek2-siRNA的SKOV3細(xì)胞為干擾組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的為陰性對(duì)照組，未經(jīng)任何處理的為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使每個(gè)樣本細(xì)胞約為1×106個(gè)。棄上清液，于離心管中加入70%的預(yù)冷乙醇1 mL，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上。檢測(cè)前1 000 r/min離心5 min，吹散細(xì)胞后用30D尼龍濾過(guò)膜過(guò)濾，減少聚在一起的細(xì)胞。用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入RNA酶，使其終濃度為50 μg/mL，37 °C孵育30 min，冰浴終止酶作用。加入5 μL 濃度為100 μg/mL碘化丙啶(PI)溶液，室溫中避光染色30 min，最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的SKOV3細(xì)胞中P27、cyclinB1、CDK1及pERK1/2蛋白表達(dá)的變化 提取各組總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，取等量樣本30 μg上樣于10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜。取出轉(zhuǎn)移好的PVDF膜，確定轉(zhuǎn)膜成功后，封閉，加一抗(1∶200)或β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入二抗(1∶5 000)，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉90 min，化學(xué)發(fā)光顯影。最后利用柯達(dá)數(shù)字科學(xué)圖像分析軟件測(cè)定蛋白印跡條帶凈灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算二者的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1Nek2-siRNA干擾后對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期的影響 轉(zhuǎn)染Nek2-siRNA 48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV3細(xì)胞周期結(jié)果表明，抑制Nek2的表達(dá)后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和干擾組處于G2/M期的細(xì)胞比例分別為：13.72%、12.27%和1.56%，干擾組細(xì)胞在S→G2轉(zhuǎn)換時(shí)受到抑制，處于G2/M期的干擾組細(xì)胞明顯減少，(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

1.空白對(duì)照組；2.陰性對(duì)照組；3.干擾組。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(n=3)

1.空白對(duì)照組；2.陰性對(duì)照組；3.干擾組；a：P<0.05，與干擾組比較。

圖2 3組SKOV3細(xì)胞中cyclinB1等表達(dá)比較(n=3)

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：干擾組；a：P<0.05，與干擾組比較。

圖3 3組SKOV3細(xì)胞中pERK1/2表達(dá)比較(n=3)

2.2NEK2-siRNA干擾后SKOV3細(xì)胞中cyclinB1、CDK1和P27蛋白表達(dá)的變化 Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48 h后，cyclinB1、CDK1的表達(dá)明顯下調(diào)，P27的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3NEK2-siRNA干擾后SKOV3細(xì)胞中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)表達(dá)的變化 Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48 h后，與空白、陰性對(duì)照組比較，pERK1/2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3 討 論

Nek2是Nek家族成員之一，目前該家族擁有11個(gè)家族成員(Nek1～11)，它們具有相似的催化序列，其中因Nek2與NIMA的同源性最高而備受關(guān)注。Nek2屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，定位于中心體，有著激酶區(qū)域的氨基末端以及未催化調(diào)節(jié)區(qū)域的羧基末端，并通過(guò)磷酸化C-Nap1、rootletin、Nlp等底物調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離[1-2]。

近年來(lái)的研究表明，Nek2是協(xié)調(diào)中心體結(jié)構(gòu)和功能的重要因子，其通過(guò)與中心體蛋白的相互作用參與微管組裝并維持微管穩(wěn)定，進(jìn)而維持中心體的穩(wěn)定[3]；通過(guò)磷酸化C-Nap1、rootletin、Nlp等底物調(diào)節(jié)紡錘體的形成和分離[1-2]；通過(guò)磷酸化高遷移率族蛋白(high-mobility group protein A2,HMGA2)參與染色質(zhì)的凝集；通過(guò)與Hec1、Mad1、Mda2的相互作用控制紡錘體檢查點(diǎn)[4-5]。Nek2表達(dá)水平具有周期依賴(lài)性，G1期時(shí)Nek2表達(dá)水平很低，但在G1/S間期其表達(dá)水平迅速上升3～4倍，并且在整個(gè)S期和G2期都保持這種高表達(dá)水平，一旦進(jìn)入M期，Nek2的表達(dá)水平迅速降低[6]。由于Nek2的表達(dá)與細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)探索Nek2基因沉默后對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的影響。本檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與兩對(duì)照組比較，Nek2表達(dá)的下降導(dǎo)致細(xì)胞周期分布出現(xiàn)異常，干擾組細(xì)胞在S→G2轉(zhuǎn)換時(shí)受到抑制，處于G2/M期細(xì)胞明顯減少。本結(jié)果表明，基因沉默Nek2可使SKOV3 細(xì)胞進(jìn)入G2/M期受阻，導(dǎo)致細(xì)胞最后不能順利通過(guò)有絲分裂期，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，從而使細(xì)胞增殖能力降低。

有研究發(fā)現(xiàn)，Nek2定位于中心體并參與調(diào)節(jié)有絲分裂[7]，其在S期和G2期保持高表達(dá)水平，具有明顯的周期依賴(lài)性[6]。結(jié)合流式檢測(cè)結(jié)果可知，抑制Nek2的表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞進(jìn)入G2/M期有明顯影響。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇cyclinB1、CDK1和P27進(jìn)行Western blot檢測(cè)，初步探討Nek2影響細(xì)胞周期的有關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48 h后，cyclinB1和CDK1的蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯下降，P27的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。根據(jù)結(jié)果可推測(cè)，Nek2基因沉默后，通過(guò)對(duì)G2/M檢查點(diǎn)關(guān)鍵因子cyclinB1和CDK1以及對(duì)抑癌基因P27的調(diào)控，抑制SKOV3細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，從而不能啟動(dòng)有絲分裂，無(wú)法進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，因此抑制了細(xì)胞增殖。Scott等[8]對(duì)漿液性卵巢腫瘤組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，cyclinB1的表達(dá)水平隨著卵巢腫瘤惡性程度的增加而增加。有研究證明，cyclinB1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如胃癌、乳腺癌、淋巴瘤等[9-11]，由此可知cyclinB1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為可通過(guò)Nek2基因沉默使SKOV3細(xì)胞中cyclinB1的表達(dá)水平下降，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extrallular signal regulated protein kinase,ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員之一，細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)因子最終都是通過(guò)磷酸化ERK來(lái)發(fā)揮作用，可以說(shuō)ERK是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)核心，調(diào)控著細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程[12]。近年來(lái)的研究證明ERK信號(hào)通路不僅參與對(duì)細(xì)胞周期G1/S的調(diào)節(jié)，而且參與對(duì)G2/M期調(diào)控[13-14]。為研究Nek2通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)調(diào)控SKOV3細(xì)胞的各種生物學(xué)行為，本實(shí)驗(yàn)對(duì)ERK1/2的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，Nek2-siRNA轉(zhuǎn)染入SKOV3細(xì)胞48 h后，與空白對(duì)照組比較，pERK1/2的表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明Nek2依賴(lài)ERK信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，使用RNAi技術(shù)特異性沉默Nek2基因能夠有效抑制細(xì)胞周期相關(guān)因子cyclinB1和CDK1的蛋白表達(dá)，同時(shí)使P27蛋白表達(dá)增加，從而抑制SKOV3細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，使其無(wú)法啟動(dòng)有絲分裂，因此抑制了細(xì)胞增殖。根據(jù)以上研究結(jié)果可推測(cè)，通過(guò)對(duì)Nek2基因進(jìn)一步的深入研究，使其有望成為臨床上監(jiān)測(cè)卵巢癌發(fā)生、發(fā)展以及評(píng)估預(yù)后的新的標(biāo)記物。Nek2基因及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)因子可作為抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要靶點(diǎn)。

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Effect of silencing Nek2 gene on cell cycle of ovarian cancer SKOV3 cells*

FanTingting1,TangLiangdan2△

(1.DepartmentofGynecology,HechuanDistrictPeople′sHospital,Chongqing401520,China;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FirstAffilliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To study the effect of silencing Nek2 via RNAi on cell cycle of ovarian cancer SKOV3 cells and the related molecular mechanism.Methods The Nek2-siRNA was transfected into the ovarian cancer SKOV3 cells.The change of cell cycle of SKOV3 cells at 48 h after transfection was examined by the flow cytometry technique;Western blot assay was used to determine the change of level of the cell cycle related factors cyclinB1,CDK1,P27 and the phosphorylation level of the ERK1/2 after Nek2-siRNA transfection for 48 h.Results The flow cytometry detection results showed that the proportion of the cells in G2/M stage in the blank control group,negative control group and RNAi group was 13.72%,12.27% and 1.56% respectively.Compared with the control group,the number of the cells in G2/M stage in the transfected group was reduced obviously(P<0.05).The Western blot detection results showed that compared with the control group,the expression of cyclinB1 and CDK1 protein in SKOV3 cells was significantly reduced,the expression of P27 was increased after silencing Nek2 and the phosphorylation level of ERK1/2 in SKOV3 cells was significantly reduced after silencing Nek2 gene(P<0.05).Conclusion Silencing Nek2 gene might block the ovarian cancer cell line SKOV3 initiating mitosis,thus inhibit their proliferation.

RNA interference;ovarian neoplasms;cell cycle;NIMA-related kinase

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.007

教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20080631001)；重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)項(xiàng)目(2009-1-59)。

范婷婷(1979-)，主治醫(yī)師，博士研究生，主要從事婦科腫瘤的診治研究。

△通訊作者，Tel：(023)89011092；Email:ldtang2002@yahoo.com.cn。

R737.31

A

1671-8348(2015)11-1463-03

2014-11-13

2014-12-28)