時國慶，馬甜甜，劉 珂 ， 劉延奇

(1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南省食品生產與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002)

膜技術制備山茱萸皂苷的研究

時國慶1,2，馬甜甜1，劉 珂1， 劉延奇1,2

(1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南省食品生產與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002)

以山茱萸皂苷轉移率和除雜率為評價指標，進行微濾和超濾實驗，對操作壓差、溫度和膜的孔徑進行優(yōu)選。結果表明：使用60%乙醇為溶劑，選擇孔徑0.45μm的陶瓷膜，在溶液溫度50 ℃、過濾壓差0.15～0.2MPa條件下，能達到較好去除提取液中的大分子膠體或細小固體微粒懸浮物的效果；選擇截留相對分子質量為10KD的超濾膜，在溶液溫度40 ℃、操作壓力0.4～0.6MPa條件下，脫除蛋白，部分色素等雜質的效果較好。膜分離技術能有效分離、純化山茱萸皂苷，工藝簡單、效率高。

山茱萸;皂苷;微濾;超濾

山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)，別稱山萸肉，為山茱萸科山茱萸屬落葉灌木或小喬木山茱萸的成熟果實[1]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為山茱萸能溫肝補腎，除一切風，可用于月經過多、老人尿頻、虛汗不止、婦女崩漏、內熱消渴等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，總皂苷為其主要活性成分之一[3]。山茱萸皂苷具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制功能[4]，能降低鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠的血糖濃度，改善糖尿病致睪丸病變的影響，同時具有免疫調節(jié)和抑菌等作用[5-8]。是相關藥品或保健食品的潛在優(yōu)質天然原料。

目前，致力于山茱萸皂苷生產工藝的應用基礎研究還不多見，且大多采用乙醇為提取溶劑，使用大孔吸附樹脂或正丁醇萃取為純化手段[9-12]。膜分離是20世紀初出現(xiàn)，20世紀60年代后迅速崛起的一門分離新技術。膜分離技術由于兼有分離、濃縮、

純化和精制的功能，又有高效、節(jié)能、環(huán)保、分子級過濾及過濾過程簡單、易于控制等特征，因此，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、環(huán)境等多個領域，產生了巨大的經濟效益和社會效益，已成為當今分離科學中最重要的手段之一[13]。本文擬采用膜技術對山茱萸皂苷純化工藝進行研究，為山茱萸皂苷的生產提供選擇。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

山茱萸，購于鄭州國藥大藥房，并經河南中醫(yī)學院楊懷霞教授鑒定，符合相關標準。R-1002-VN及R-1010旋轉蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿有限公司；SP-756PC紫外—可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；BT224S分析天平，德國賽多利斯公司；SHZ-2000型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；實驗室陶瓷膜及超濾膜分離設備，上海朗極膜分離設備工程有限公司。人參皂苷Re對照品(≥98%)，中國藥品生物制品檢定所；甲醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等試劑，均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

準確稱取人參皂苷Re對照品20 mg，甲醇溶解，10 mL容量瓶定容，配制成濃度為2 g/L的溶液。準確移取此溶液30、45、60、75、90 μL于10 mL具塞試管中，熱風吹干溶劑，加入5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后，置于60 ℃水浴中，15 min后取出冰水浴冷卻3 min，再加入5 mL冰醋酸，搖勻，轉入比色皿中，545 nm處測吸光值，以不加對照品溶液的試劑做空白，繪制標準曲線[11]。

1.2.2 山茱萸提取液的制備

將山茱萸粉碎成380 μm(40目)左右的粗粉，以體積比為60%的乙醇作為提取溶劑，提取溫度70 ℃，料液比1∶20，提取時間1 h，提取一次，過濾，取一部分提取液直接進行膜分離實驗，另一部分減壓濃縮蒸去乙醇后，加水稀釋至濃縮前體積進行膜分離實驗。

1.2.3 微濾

分別使用以水和60%為溶劑的提取液，選用孔徑分別為0.14、0.45、0.8和1.4 μm的陶瓷膜以全回流方式循環(huán)運行，操作壓差0.2 MPa，溫度50 ℃，考察膜通量隨運行時間的變化，每10 min測定一次，當膜通量基本穩(wěn)定以后，停泵，測定透過液皂苷濃度、提取液皂苷濃度和固形物含量，計算除雜率和皂苷轉移率，以確定合適的膜孔徑和溶劑。確定合適的膜孔徑和溶劑后，在料液溫度為30、50、70和80 ℃條件下進行實驗，計算除雜率和皂苷轉移率，以確定較優(yōu)溫度。在較優(yōu)條件下改變壓差，測定膜通量，以確定合適的運行壓力。實驗采用管式陶瓷膜，膜面積0.04 m2，以單管道、錯流循環(huán)方式進行，流速和壓差由閥門和進口壓力控制。除雜率和皂苷轉移率按下面公式計算：

除雜率=[(原液固形物含量-透過液固形物含量)/ 原液固形物含量]×100%

(1)

皂苷轉移率=(透過液皂苷含量 / 原液皂苷含量)×100%

(2)

1.2.4 超濾

使用較優(yōu)條件下的微濾透過液，分別選用截留相對分子質量為50、30、10、5和2.5KD的卷式聚醚砜膜，以全回流方式循環(huán)運行，操作壓差為0.6 MPa，溫度40 ℃，考察膜通量隨運行時間的變化，每10 min測定一次，當膜通量基本穩(wěn)定以后，停泵，測定超濾透過液皂苷濃度、微濾透過液皂苷濃度和固形物含量，計算除雜率和皂苷轉移率，以確定合適的膜孔徑和溶劑。在料液溫度為20、30、40 ℃條件下進行實驗，計算除雜率和皂苷轉移率，以確定較優(yōu)溫度。在較優(yōu)條件下改變壓差，測定膜通量，以確定合適的運行壓力。在較優(yōu)條件下計算除雜率和皂苷轉移率和產品純度。實驗采用卷式聚醚砜膜，膜面積0.24 m2，以錯流循環(huán)方式進行，流速和壓差由閥門和進口壓力控制。

1.2.5 固形物得率的測定

量取100 mL的超濾液，置于已恒重的圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，干燥箱恒重，減量法得固形物質量，計算固形物得率。

1.2.6 山茱萸皂苷的測定

準確移取不同條件下過陶瓷膜前和超濾膜前后的提取液樣品各100 mL，分別使用水飽和的正丁醇萃取，正丁醇相真空濃縮除去溶劑，固形物甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，定容，取一定量按1.2.1項方法處理，545 nm處測吸光值，計算樣品皂苷濃度。根據(jù)固形物得率計算產品純度。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

以人參皂苷Re濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 皂苷標準曲線

根據(jù)結果作線性回歸，得到吸光值和濃度關系的方程為：

A=4.372C-0.017

(3)

R2=0.999，說明在試驗濃度范圍內兩者具有良好的線性關系。

2.2 微濾過程

微濾主要用于對提取液進行預處理，以去除大分子膠體或細小固體微粒，影響微濾效果的主要有溶劑、膜孔徑、溫度、流速和壓差等因素。

2.2.1 膜孔徑的選擇

分別以60%乙醇和水為溶劑，不同膜孔徑下其膜通量隨時間變化的情況如圖2所示，不同膜孔徑下皂苷轉移率和除雜率情況如表1所示(實驗結果用均值±標準差表示，n=3，下同)。

圖2 不同膜孔徑下膜通量與時間的關系

表1 不同膜孔徑下的除雜率和皂苷轉移率

由圖2和表1可知，用水作溶劑，與60%乙醇相比，在膜孔徑相同情況下，其除雜率和皂苷轉移率均較低，這可能和皂苷在水中的溶解度不如在60%乙醇有關，也可能是用水提取得到一些低極性成分，這些低極性成分和皂苷形成不溶于水的復合物被陶瓷膜截留下來，從而造成這種現(xiàn)象。用水作溶劑較大孔徑的膜除雜率更高而皂苷轉移率更低應與膜污染速度較快有關，圖2中不同膜孔徑下膜通量隨時間變化的情況也證明了這一點。與60%乙醇為溶劑相比，相同孔徑的膜運行相同時間，以水為溶劑的膜通量較低，因此，不對提取液處理，直接采用60%乙醇提取液進行微濾除雜比較適宜。在以60%乙醇為溶劑的情況下，不同孔徑的膜膜通量相差不大，而皂苷轉移率隨著膜孔徑增大而增大，考慮到除雜率，選取0.45 μm的膜作為進一步實驗的材料。

2.2.2 溫度對微濾效果的影響

以60%乙醇為溶劑，使用孔徑為0.45 μm的膜，研究不同溫度下膜通量隨時間變化的情況，結果如圖3所示，不同溫度下皂苷轉移率和除雜率情況如表2所示。

圖3 不同溫度下膜通量與時間的關系

表2 不同溫度下的除雜率和皂苷轉移率

由圖3和表2可知，溫度對微濾效果的影響較大，在30～70 ℃，隨著溫度的升高，膜通量、皂苷轉移率逐漸升高，除雜率逐漸下降，這可能和升高溫度能降低料液黏度和提高皂苷溶解度有關。80 ℃時，膜通量和皂苷轉移率反而較低，原因可能是較高的溫度使得提取液中的一些物質性質發(fā)生改變，溶解度下降，膜對這些物質的吸附量增加而導致膜通量降低。50 ℃和70 ℃條件下，兩者的膜通量、皂苷轉移率和除雜率相差不是很大，考慮到能耗問題，選擇50 ℃比較適宜。

2.2.3 操作壓差對微濾效果的影響

對于采用壓力驅動的微濾過程，存在一個臨界壓力，在臨界壓力之下，壓差越大膜通量也就越大，但當壓力高于臨界壓力時，由于膜面形成了凝膠層，壓差對膜通量影響不大，微濾過程一般選在低于臨界壓力的中壓區(qū)，可以在保持較高膜通量的情況下，降低能耗減少膜污染。不同操作壓差條件下，膜通量變化的情況如圖4所示。

圖4 膜通量與壓差的關系

由圖4可知，當微濾膜兩端的壓力差超過0.2 MPa時，膜通量和壓差的關系不大，考慮到能耗和膜污染的問題，微濾操作運行時，膜壓力應維持在0.15～0.20 MPa。

2.3 超濾過程

超濾主要用于脫除蛋白、部分色素等雜質，以進一步純化山茱萸皂苷。

2.3.1 膜孔徑的選擇

不同孔徑超濾膜膜通量隨時間變化的情況如圖5所示，皂苷轉移率及除雜率測定結果見表3。

圖5 不同膜孔徑下膜通量與時間的關系

由圖5和表3可知，不同孔徑的超濾膜，膜通量差別不是很大。使用50、30、10 KD的超濾膜，其皂苷轉移率相差不大，其除雜率隨著膜孔徑的減小而逐漸增大。5、2.5 KD的超濾膜皂苷轉移率較小，選擇10 KD的超濾膜較為適宜。

表3 不同膜孔徑下的除雜率和皂苷轉移率

2.3.2 溫度對微濾效果的影響

由于膜材料最佳運行溫度在45 ℃以下，使用10 KD的聚醚砜卷式膜，選擇20、30和40 ℃考察溫度對膜通量的影響，結果如圖6所示，不同溫度下皂苷轉移率除雜率關系如表4所示。

圖6 不同溫度下膜通量與時間的關系

表4 不同溫度下的除雜率和皂苷轉移率

雖然隨著溫度的升高，整個體系的黏度會下降，但由圖6和表4結果可知，溫度對超濾效果影響不大，這可能是經過微濾，一些影響超濾效果的物質已經被除去，皂苷在實驗濃度條件下，其在溶劑中的溶解情況受溫度影響不大，但提高溫度，對增加膜通量有一定的好處，考慮到前面微濾在50 ℃條件下運行，超濾操作選擇40 ℃作為操作溫度。

2.3.3 操作壓差對超濾效果的影響

不同操作壓差條件下，膜通量變化的情況如圖7所示。

圖7 膜通量與壓差的關系

由圖7可以看出，當微濾膜兩端的壓力差超過0.6 MPa時，膜通量和壓差的關系不大，考慮到能耗和膜污染的問題，微濾操作運行時，膜壓力應維持在0.4～0.6 MPa。

以60乙醇為溶劑，使用微濾結合超濾對山茱萸皂苷進行存化，去除大分子雜質(微濾條件：0.45 μm陶瓷膜，操作溫度 50 ℃、過濾壓差0.2 MPa；超濾條件：10 KD聚醚砜卷式膜，操作溫度 40 ℃、過濾壓差0.6 MPa)，透過液濃縮干燥后產品純度可達66.80% ，皂苷總轉移率為87.10%。

3 結論

使用微濾結合超濾處理山茱萸提取液，能有效去除大分子雜質，過濾過程簡單、易于控制，產品純度高。

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Purification of Total Saponins of Cornus officinalis by Membrane Separations Technology

SHI Guoqing1,2, MA Tiantian1, LIU Ke1, LIU Yanqi1,2

(1.School of Food and Bioengineering , Zhengzhou University of Light Industry , Zhengzhou 450002 , China ; 2.Henan Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety , Zhengzhou 450002 , China)

The optimized pores,temperature and differential pressure were presented according to the membrane flux,metastasis rate of saponin and elimination rate of impurity by microfiltration and ultrafiltration experiments.The results showed that the effect of removing suspended solids and the macromolecular impurities from the extract was better using ceramic membrane with pore size of 0.45μm under the filtration pressure of 0.15～0.20 MPa and at 50 ℃ in 60 % alcohol.The effect of removing proteins and part of the pigments was better using ultrafiltration membrane with withheld molecularweight of 10KD under the operating pressure of 0.4-0.6MPa and at 40℃. Membrane separation technique is a simple and reliable technique, and can be used to separate and purify the saponins extracted from the Cornus officinalis effectively.

cornus officinalis sieb. et zucc. ; saponin ; microfiltration ; ultrafiltration

2015-06-02

鄭州輕工業(yè)學院校內科研基金項目

時國慶 (1973-) ，男，博士，講師，從事天然產物研究與開發(fā)工作，電話：13937145306；聯(lián)系人：劉延奇(1964-)，男，博士，教授，從事功能性多糖研究與開發(fā)工作，E-mail: liuyanqi@zzuli.edu.cn。

TQ

A