樊景鳳，明紅霞，王小慧，李洪波，石峰，3，穆貴強，趙順

(1.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116023；2. 國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，遼寧 大連 116023；3. 南開大學 環(huán)境科學與工程學院，天津 300071)

北黃海微表層細菌豐度與可培養(yǎng)細菌群落結構分析

樊景鳳1，2，明紅霞1，2，王小慧1，2，李洪波1，2，石峰1，2，3，穆貴強1，2，趙順1，2

(1.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連 116023；2. 國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，遼寧 大連 116023；3. 南開大學 環(huán)境科學與工程學院，天津 300071)

為分析海洋微表層這一特殊生境中的細菌類群，于2010—2011年4個航次對北黃海微表層和次表層海水中的總菌豐度、可培養(yǎng)細菌豐度和群落結構進行了分析。采用流式細胞儀測定總菌豐度，平板計數(shù)法測定可培養(yǎng)細菌豐度，PCR-16S rDNA分析可培養(yǎng)細菌的群落結構。結果表明，調查海域微表層海水總菌均值為1.76×106cell/mL，次表層海水總菌均值為1.07×106cell/mL。可培養(yǎng)細菌豐度范圍是1.00×102～1.70×106CFU/mL，微表層和次表層可培養(yǎng)細菌所占總菌數(shù)量的百分比分別為13.05%和0.45%。微表層對總菌的富集因子(EF)均值為2.02，可培養(yǎng)細菌的EF均值為74.16。PCR-16S rDNA序列分析結果表明，該海域可培養(yǎng)細菌分屬變形菌門(Proteobacteria)(94.34%)、厚壁菌門(Firmicutes)(1.89%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(1.89%)和放線菌門(Actinobacteria)(1.89%)4個類群。本研究初步發(fā)現(xiàn)，微表層對細菌具有較強的聚集作用，尤其對可培養(yǎng)細菌聚集作用更為明顯。微表層中可培養(yǎng)細菌的群落結構與次表層有所不同，其種類豐富，來源和功能多樣。由此可見，微表層獨特的生境成就了其獨特的微生物類群，其生態(tài)功能有待于進一步研究。

微表層；次表層；總菌；可培養(yǎng)細菌；群落結構

1 引言

微表層(surface microlayer，SML)是指大氣和水體之間位于水-氣交換界面的厚度為1～1 000 μm的微生境，為加以區(qū)分，將微表層以下0.5 m內(nèi)的水層定義為次表層(subsurface layer，Sub-)[1]。微表層被認為是大氣沉降物的匯，相對于次表層，其物理、化學和生物過程明顯不同[2]。棲息在微表層水中的微生物受到有利因素(如高濃度的無機和有機營養(yǎng))和不利因素(強烈光照、高濃度的重金屬、有機污染、溫度和鹽度波動較大)的雙重作用，形成了一個含有獨特微生物物種和種群的特殊類群[3]。因此，海洋微表層研究已成為眾多化學家、物理學家和生物學家所矚目的學科前沿，國際上有關海洋微表層的研究已較豐富，有關微表層化學元素的富集作用、群落結構、細菌活性等研究逐漸被重視，研究內(nèi)容正由微表層的物理化學性質轉向微生物生態(tài)學方向發(fā)展[4—7]。我國學者已經(jīng)在廈門港、渤海、熱帶太平洋海域、珠江口、南沙群島等多個海域開展了微表層營養(yǎng)鹽、有機物、痕量金屬、化學性質等方面的系統(tǒng)研究[8—11]，然而，到目前為止，有關微表層微生物生態(tài)學的研究尚未見報道。

不同的營養(yǎng)體系微表層的性質差別很大，如貧營養(yǎng)水域較富營養(yǎng)水域微表層對有機物濃度、微生物及其活性有相當大的富集[12]，而且，污染區(qū)環(huán)境中微表層的細菌豐度和種類不同于非污染區(qū)[13]。由于北黃海具有特殊的地理位置和獨特的冷水團現(xiàn)象，其海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生物組成和群落結構穩(wěn)定特征受到人們的廣泛關注。而微生物群落作為該海域生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其群落結構和分布特征等相關研究亟待開展?；诖耍狙芯窟x取北黃海8個站位，在分析其微表層和次表層海水總菌和可培養(yǎng)細菌分布特征的基礎上，構建可培養(yǎng)細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，探討其可培養(yǎng)細菌群落的結構和分布特征，該研究將從一個全新的視角深層次理解該水域的生態(tài)系統(tǒng)結構和功能，也可為我國近海微生物資源及生態(tài)環(huán)境的研究提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

分別于2010年6月、8月和2011年3月和7月采集北黃海8個站位(圖1)的微表層和次表層海水，樣品采集時晴天，風速小于3級。

微表層水樣采用玻璃板法[13]收集：采樣前用75%的乙醇(體積比)洗滌玻璃板(規(guī)格為30 cm×40 cm×5 cm)和橡膠棒，而后用蒸餾水沖洗干凈。采樣時將平板玻璃垂直浸入水中，然后以20 cm/s左右的速度提起，用硅橡膠刮片自板的兩面將水膜刮下，將微表層水樣收集到滅菌的水樣瓶中，約50 mL。為減少由蒸發(fā)帶來的誤差，玻璃板暴露在空氣的時間要少于10 s。

次表層水樣使用采水器收集，用采水器在海平面下0.5 m處采集水樣200 mL，保存于4℃，運回實驗室分析。

2.2 總菌計數(shù)

總菌用流式細胞儀進行計數(shù)[14]，樣品室溫融化后，用市售的GenefinderTM染料(10 000∶1)染色，室溫下黑暗處理10～15 min。用流式細胞儀(BD Aria I)，在藍色激發(fā)光488 nm下(15 mW氬激光)，用綠色濾光片[波長(530±15)nm]測量。閾值設在綠色熒光FITC上，加入1 μm 標準微球做內(nèi)參。

2.3 可培養(yǎng)細菌計數(shù)及革蘭氏染色

采用平板培養(yǎng)法計數(shù)微表層和次表層海水中的可培養(yǎng)細菌總數(shù)。在取樣后的1 h內(nèi)接種于海洋瓊脂(Marine Agar)2216E(Difco)培養(yǎng)基，每個水樣設2個稀釋度，各3個重復，每個稀釋度取100 μL樣品均勻涂布，所有培養(yǎng)基于25℃倒置培養(yǎng)1～2周后記菌落數(shù)。

對純化后的細菌進行革蘭氏染色，并對所獲得細菌進行初步篩選和鑒定。

2.4 可培養(yǎng)細菌的分子鑒定

2.4.1 模板制備

根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色、透明度、邊緣是否光滑和菌落是否濕潤等特征挑選菌落，然后用TIANGEN細菌基因組提取試劑盒提取總DNA，作為聚合酶鏈反應(PCR)的模板。

2.4.2 細菌16S rDNA的PCR擴增

選擇細菌16S rDNA通用引物27 F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1 492 R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)進行序列擴增，擴增產(chǎn)物片段約1 460 bp。反應采用50 μL體系，同時設置陰性對照，反應條件參照前期研究[15]。電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2.5.1 流式數(shù)據(jù)處理

利用Win MDI 2.9軟件對測定結果進行分析。以488 nm激光光源為激發(fā)光，以FITC、SSC、PerCP-Cy5-5-H和PE-H為坐標進行分析。FITC(異硫氰酸熒光素)被488 nm激發(fā)，在530 nm發(fā)出綠色熒光；SSC(Side light Scatter)為側散射光，其強度與細胞的表面和內(nèi)部結構及其大小和形狀有關，有時專指粒度信號；PE(藻紅蛋白)在575 nm激發(fā)呈現(xiàn)橙黃色，PerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白)在675 nm激發(fā)發(fā)出深紅色光。

2.5.2 構建系統(tǒng)發(fā)育樹

為進一步弄清北黃海可培養(yǎng)細菌的多樣性和群落結構，將測序結果提交Genbank進行檢索，利用BLAST功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行DNA序列匹配，得到各序列與已知細菌序列同源性的比對結果，采用clustalx1.83和MEGA 3.1對測得的DNA序列進行聚類分析，用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)生樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

3 結果

3.1 北黃海表層和微表層海水中總菌數(shù)量分布

經(jīng)流式細胞儀測得海水中總菌的數(shù)量，最小值出現(xiàn)在2010年6月份B1站位的次表層，為1.75×105cell/mL；最大值出現(xiàn)在2011年7月份BY5站位的微表層，為4.57×106cell/mL；各時段各站位微表層海水中的總菌數(shù)均高于翌表層海水中的總菌數(shù)。微表層總菌數(shù)量在2010年8月份達到最高值，翌年3月份降低，7月份又回升；次表層2010年6月、8月和來年3月總菌數(shù)量變化不大，翌年7月份升高，達到4個月份的最高值(圖2)。

圖2 微表層(a)和次表層(b)海水中總菌數(shù)量變化趨勢Fig.2 The change trend of the total bacteria number in surface microlayer(a) and subsurface layer(b) seawater

3.2 北黃海微表層和次表層海水中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量分布

各站位海水中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量變化范圍為1.00×102～1.70×106CFU/mL，最小值出現(xiàn)在2011年7月份B1站位的次表層，最大值出現(xiàn)在2010年8月份B3站位的微表層；微表層和次表層可培養(yǎng)細菌數(shù)最大值均出現(xiàn)在2010年8月份的航次中，微表層可培養(yǎng)細菌數(shù)量高于次表層2個數(shù)量級；除離岸最遠的A3站位微表層外，其他站位可培養(yǎng)細菌數(shù)量在2010年8月份達到高峰后，在翌年3月份降低，繼而7月份又有所回升(圖3)。整體而言，微表層和次表層海水中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量變化受溫度影響較大。

圖3 微表層(a)和次表層(b)可培養(yǎng)細菌數(shù)量變化趨勢Fig.3 The change trend of the culturable bacteria number in surface microlayer(a) and subsurface layer(b) seawater

3.3 可培養(yǎng)百分比

本研究中，4個航次采集的海水可培養(yǎng)細菌占總菌數(shù)量的百分比(可培養(yǎng)百分比)范圍為0.01%～86.79%，最小值出現(xiàn)在2011年7月份的B1站位的次表層，最大值出現(xiàn)在2011年3月份的A3站位的微表層；各時段各站位微表層海水中可培養(yǎng)細菌占總菌數(shù)量的百分比均高于次表層(表1)。

表1 微表層和次表層海水中可培養(yǎng)細菌占總菌數(shù)量的百分比Tab.1 The percentage of the number of culturable bacteria to total bacteria number in surface microlayer and subsurface layer seawater

3.4 富集因子變化

用富集因子(Enrichment Factor，EF)來評價微表層的富集作用。富集因子是指某一成分在微表層的濃度與它在次表層的濃度比值。在本研究中，微表層總菌的EF變化范圍較小，為0.40～5.76，可培養(yǎng)細菌的EF變化范圍較大，為0.59～500.00；2010年6月、2010年8月、2011年3月和2011年7月微表層可培養(yǎng)細菌的平均富集因子分別為43.41、139.54、91.02和22.67，其中2010年8月航次微表層可培養(yǎng)細菌的富集因子最高(表2)。

表2 微表層海水中總菌和可培養(yǎng)細菌的富集因子Tab.2 EF of the total bacteria and culturable bacteria in surface microlayer seawater

3.5 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

共分離出164株細菌，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化鑒定，最后確定53株細菌進行16S rDNA序列分析。53株細菌中，微表層中36株，次表層中17株。大部分細菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列有較高相似性(不小于98%)(表3)。選取親緣關系較近的菌種，采用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4)。

表3 可培養(yǎng)細菌16S rDNA測序結果與GenBank中序列的比對結果Tab.3 The results of comparision between the culturable bacteria 16S rDNA sequences and the known sequences in Genbank

續(xù)表3

續(xù)表3

圖4 可培養(yǎng)細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of the culturable bacteria▲：微表層中分離到的細菌；■：次表層中分離到的細菌；○：數(shù)據(jù)庫中已知序列▲：The isolated bacteria from surface microlayer；■：The isolated bacteria from subsurface layer；○：The known sequences in the Genbank

基于16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析結果表明，53株細菌所測序列分屬于變形菌門(Proteobacteria)(94.34%)、厚壁菌門(Firmicutes)(1.89%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(1.89%)和放線菌門(Actinobacteria)(1.89%)4個類群。在微表層中，變形菌門占97.2%(34/36)，其中γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)占91.7%(33/36)，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)占5.6%(2/36)。此外，擬桿菌門占2.8%(1/36)；在次表層中，變形菌門占88.2%(15/17)，其中γ-變形菌綱占58.9%(10/17)，α-變形菌綱占29.4%(5/17)，此外，厚壁菌門占5.9%(1/17)，放線菌門占5.9%(1/17)。該海域所分離的53株菌中，γ-變形菌綱分屬于9個屬：5株屬于交替單胞菌屬(Alteromonas)、4株屬于海桿菌屬(Marinobacter)、1株屬于Idiomarina、19株屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、2株屬于Cobetia、3株屬于鹽單胞菌屬(Halomonas)、1株屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)、6株屬于冷桿菌屬(Psychrobacter) 、2株屬于弧菌屬(Vibrio)。α-變形菌綱的細菌分屬于3個屬：4株分屬于副球菌屬(Paracoccus)、2株屬于赤桿菌屬(Erythrobacter)、1株屬于Maricaulis。

4 討論

比較微表層和次表層海水中總菌和可培養(yǎng)細菌數(shù)量可知，微表層對細菌具有一定的聚集作用。微表層海水中的總菌EF值較小，且變化范圍較小，其原因可能是由于顆粒黏附細菌(particle-attached bacteria)無法被流式細胞儀識別并計數(shù)，但這類細菌在總細菌中占有相當大的比例[16]。與總菌相比，微表層海水中可培養(yǎng)細菌EF值較大，且變化范圍也較大，其原因可能是在細菌培養(yǎng)計數(shù)前先進行細菌細胞分散，計數(shù)誤差相對較小，從另一側面也反映了微表層可能對可培養(yǎng)細菌具有很好的聚集作用，其獨特的生境更利于其生存。微表層中可培養(yǎng)細菌富集的原因可以解釋如下：(1)微表層中高濃度的溶解和膠體有機化合物為細菌的生長提供了能量與營養(yǎng)[14]；(2)微表層中有“保護劑”來應對脅迫因子，如太陽輻射、高溫或鹽度變化、毒性有機物和重金屬等脅迫[2，17]。

海洋微表層與大氣直接接觸，容易受到太陽輻射的影響，具備富集大量有機與無機物質等獨特的自身條件，形成微表層獨特的微生境，其細菌多樣性較次表層更為豐富，并且有著更高的細菌活性[18]。在北黃海海域的微表層海水中發(fā)現(xiàn)某些菌株與硫酸鹽還原菌、環(huán)硝銨降解菌、石油降解菌、抗紫外菌、烴降解菌、咔唑降解菌、反硝化細菌、多環(huán)芳烴降解菌、嗜冷菌、嗜鹽菌等菌屬有很高的相似性，且分離到與產(chǎn)胞外酶菌、產(chǎn)蛋白酶菌、產(chǎn)幾丁質酶菌、產(chǎn)多飽和脂肪酸嗜鹽菌等菌屬相似性高的菌株，而這些細菌在次表層海水中沒有被分離到，表明海洋微表層這一特殊生境中存在大量與生物地球化學循環(huán)相關的微生物。

在研究微表層海水細菌多樣性的同時，可探討其生物來源的問題，為微表層特殊細菌群落結構形成的原因提供一定的參考價值。本研究通過鑒定發(fā)現(xiàn)，微表層細菌來源多樣化，相似性細菌分離于海洋、土壤、海底山、鹽沼平原、海藻碎屑、紅樹林根部以及海產(chǎn)品等多種環(huán)境。目前有兩種說法：一是認為微表層中生物體的源是由物理過程引起的生物體的向上傳送而不是由原位發(fā)展起來的[19]；另一種觀點是微表層的微生物主要是外來的，微表層復雜多變的動態(tài)特征導致了外源生物的引入[5]。由本研究對可培養(yǎng)細菌的群落結構初步分析可知，北黃海微表層可培養(yǎng)細菌的來源更傾向于外源輸入。整體而言，微表層中各種細菌的親緣關系更為接近，次表層亦是，而微表層與次表層細菌總體的的親緣關系要遠一些。

5 結論

北黃海微表層對細菌具有較強的富集作用，微表層海水中的細菌群落結構獨特；在微表層中，除1株細菌屬于擬桿菌門外，分離得到的細菌都屬于變形菌門，并且大部分屬于變形菌門中的γ-變形菌綱；北黃海微表層中可培養(yǎng)細菌主要為外源輸入。

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Analysis on the bacterial abundance and community structure of culturable bacteria in the surface microlayer of the northern Yellow Sea

Fan Jingfeng1，2，Ming Hongxia1，2，Wang Xiaohui1，2，Li Hongbo1，2，Shi Feng1，2，Mu Guiqiang1，2，Zhao Shun1，2

(1.NationalMarineEnvironmentalMonitoringCenter，Dalian116023，China; 2.KeyLaboratoryofCoastalEcologyandEnvironmentofStateOceanicAdministration，Dalian116023，China; 3.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity，Tianjin300071)

In order to learn the bacterial taxa in unique microhabitat of the surface microalyer，the total numbers of bacteria，culturable bacteria and its community structure were investigated from the surface microlayer and subsurface layer of the northern Yellow Sea. Seawater samples were collected from four sampling times，2010-2011. The total number of bacteria was determined by flow cytometry. The number of culturable bacteria was determined by the plate count method. PCR-16S rDNA and sequencing analysis were used to analyze the features of community structure. The results showed that the average numbers of total bacteria are 1.76×106CFU/mL in the surface microlayer and 1.07×106cell/mL in subsurface layer，respectively. The number of culturable bacteria ranged from 1.00×102CFU/mL to 1.70×106CFU/mL. The percentage that culturable bacteria occupies in total bacteria were 13.05% and 0.45% in the surface microlayer and subsurface layer，respectively. The enrich factor (EF) of total and cultural bacteria were 2.02 and 74.16 in the surface microlayer. The results showed that the culturable bacteria in this region was attached to four phylogenetic communities: Proteobacteria (94.34%)、Firmicutes (1.89%)、Bacteroidetes (1.89%) and Actinobacteria (1.89%). This research preliminary presented that the surface microlayer in seawater has an high enrichment effect on bacteria，especially for culturable bacteria. The bacterial communities in the surface microlayer and subsurface layer was different，which reflected in wide range of species，diversity of source and function. Therefore，the unique bacterial communities of the surface microlayer is generated towing to its special microhabitat. The ecological function of microorganisms in surface microlayer need to be further understood in the future.

surface microlayer; subsurface layer; total bacteria; culturable bacteria; community structure

2015-03-23；

2015-07-22。

海洋公益性行業(yè)科研專項(201105021，201305030，201405007)；“全球變化與海氣相互作用”專項(GASI-03-01-02-05)。

樊景鳳(1972—)，女，黑龍江省明水縣人，博士，研究員，主要從事海洋微生物學與海洋生態(tài)學研究。E-mail：jffan@nmemc.org.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.012

Q938.8

A

0253-4193(2015)10-0123-10

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