寧寅寬，李 強(qiáng)，蔡偉良，武成聰，陳佳濱，石正松

組織工程骨表面微觀形貌和生物礦化的實(shí)驗(yàn)研究

寧寅寬，李 強(qiáng)，蔡偉良，武成聰，陳佳濱，石正松

目的用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記結(jié)合掃描電鏡和X射線能譜分析（SEM／EDS）技術(shù)對(duì)組織工程骨的表面微觀形貌和生物礦化進(jìn)行觀測(cè)，以評(píng)價(jià)脫鈣骨（DBM）支架體外構(gòu)建組織工程骨的生物性能。方法用重組腺病毒介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）進(jìn)行示蹤標(biāo)記，細(xì)胞與DBM復(fù)合經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行即時(shí)觀察，結(jié)合SEM／EDS技術(shù)，觀測(cè)組織工程骨的表面微觀形貌和生物礦化。結(jié)果在倒置熒光顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞在DBM支架上能較好的黏附、重疊生長(zhǎng)和增殖，體外培養(yǎng)至14 d時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GFP有較高水平瞬時(shí)表達(dá)。SEM見(jiàn)DBM呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙直徑為300～600 μm，孔隙率達(dá)90%。SEM下觀察組織工程骨，見(jiàn)細(xì)胞在DBM網(wǎng)孔內(nèi)表面貼壁生長(zhǎng)，分泌基質(zhì)旺盛，并可見(jiàn)粗糙的生物礦化物覆蓋支架。EDS顯示其表面為鈣、磷沉積物，其鈣磷比（Ca／P）為1.46。結(jié)論 DBM體外構(gòu)建組織工程骨有非常好的生物性能，GFP標(biāo)記結(jié)合SEM／EDS技術(shù)可以作為DBM體外構(gòu)建組織工程骨較好的評(píng)價(jià)手段。

重組腺病毒；綠色熒光蛋白；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脫鈣骨基質(zhì)；能譜分析

骨組織工程概念的提出為骨組織缺損的再生修復(fù)提供新的治療手段，種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子是骨組織工程的3大要素，也是組織工程骨移植到體內(nèi)發(fā)揮功能的重要因素［1］。松質(zhì)骨經(jīng)過(guò)脫脂、脫鈣等處理后，內(nèi)含有骨形態(tài)形成蛋白生長(zhǎng)因子［2］，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）復(fù)合可體外構(gòu)建組織工程骨。但是在構(gòu)建組織工程骨及對(duì)其生物活性進(jìn)行深入研究時(shí)，對(duì)BMSCs在支架上的黏附、分布和生長(zhǎng)情況無(wú)較理想的即時(shí)觀測(cè)方法［3］，對(duì)脫鈣骨（demineralized bone matrix，DBM）體外構(gòu)建組織工程骨的表面礦化研究，國(guó)內(nèi)外也鮮有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)用重組腺病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs進(jìn)行示蹤標(biāo)記，結(jié)合掃描電鏡和X射線能譜分析（scanning electron microscope and energy dispersive spectrometer，SEM／EDS）技術(shù)，觀測(cè)組織工程骨的微觀形貌和生物礦化，以評(píng)價(jià)DBM體外構(gòu)建組織工程骨的生物性能，為后期組織工程骨體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1腺病毒載體 Ad-GFP表達(dá)載體由美國(guó)英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司構(gòu)建、鑒定和提供。采用免疫法檢測(cè)腺病毒滴度，病毒滴度為2×1010pfu／ml。

1.1.2兔BMSCs制備 本課題組前期實(shí)驗(yàn)已完成了兔BMSCs的獲取、培養(yǎng)及鑒定，并取第5代細(xì)胞加入凍存保護(hù)液，程序降溫后液氮保存?zhèn)溆茫?］。本次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為第5代凍存細(xì)胞復(fù)蘇后傳代至第10代的BMSCs。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭大白兔1只，6月齡，3.2 kg，清潔級(jí)，購(gòu)于桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.4主要儀器和試劑 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；維生素C、β-磷酸甘油、地塞米松（韓國(guó)BIOSHARP公司）；脫鈣液（濃鹽酸15 ml、氯化鈉175 g、蒸餾水1 000 ml）、戊二醛（美國(guó)Sigma公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientifc公司）；生物安全柜（中國(guó)蘇凈安泰公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；場(chǎng)發(fā)射SEM（荷蘭飛利浦公司）；EDS儀（英國(guó)牛津公司）。

1.2 方法

1.2.1 DBM制備參考文獻(xiàn)［5］方法制作DBM基質(zhì)。將健康雄性新西蘭大白兔麻醉后處死，取四肢骨干骺端、椎體及髂骨松質(zhì)骨，－80℃冰箱凍存3 d。除去附著肌肉和骨膜，放入脫鈣液中脫鈣3 d。再將骨塊置于乙醚、無(wú)水乙醇中脫脂各1 d，以無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗、浸泡，至浸泡液呈中性。脫鈣松質(zhì)骨自然晾干，剪成大小約2 mm×3 mm×5 mm塊狀，環(huán)氧乙烷消毒，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2兔BMSCs的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將待復(fù)蘇的兔BMSCs凍存管迅速解凍，轉(zhuǎn)移至含有3倍于凍存保護(hù)液體積的L-DMEM離心管中1 500 r／min離心5 min，棄上清液。細(xì)胞沉淀中加入5 ml完全培養(yǎng)基，充分吹打細(xì)胞懸液至細(xì)胞分布均勻，以含15%血清的L-DMEM完全培養(yǎng)基（含100 IU／ml青霉素、100 IU／ml鏈霉素）接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇24 h后換液。各代BMSCs體外培養(yǎng)至單層細(xì)胞匯合約80%，用0.25%胰蛋白酶消化，行1∶2～3傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳至第10代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI＝100），用重組腺病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后換液。

1.2.3轉(zhuǎn)染后兔BMSCs與DBM復(fù)合構(gòu)建組織工程骨 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重懸，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每個(gè)25 cm2塑料培養(yǎng)瓶細(xì)胞數(shù)目，收集1×108個(gè)數(shù)量細(xì)胞。用離心機(jī)低速離心（1 500 r／min，5 min）后，棄上清液，用1 ml完全培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞，以調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)／ml，與DBM基質(zhì)復(fù)合，次日更換骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10 nmol／L地塞米松、15 mmol／L維生素C、10 mmol／L β-磷酸甘油、pH＝7.3），孵育1周后，更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在倒置熒光顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞在DBM上的黏附、分布和增殖情況。

1.2.4DBM和組織工程骨在SEM下的表面微觀形貌及EDS分析 將構(gòu)建的組織工程骨在體外培養(yǎng)2周后，用2.5%戊二醛固定，梯度丙酮脫水，并與DBM同時(shí)真空干燥，噴金鍍膜，在Quanta 200 FEG場(chǎng)發(fā)射環(huán)境SEM和EDS儀上進(jìn)行測(cè)試。在SEM下觀察DBM和構(gòu)建的組織工程骨表面微觀形貌，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)計(jì)算DBM的孔徑和孔隙率。隨機(jī)獲取檢測(cè)微區(qū)，用EDS儀測(cè)定微區(qū)主要元素（C、O、Ca、P）的重量百分比和原子百分比百分含量，重復(fù)3次。EDS技術(shù)指標(biāo)：電壓10 kV，電子束6.0，工作距離為9.0 mm。

2 結(jié)果

2.1 組織工程骨在倒置熒光顯微鏡下的觀察參考本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法［5］，測(cè)定細(xì)胞黏附率為71%。細(xì)胞黏附DBM后，在倒置熒光顯微鏡下選擇同一部位觀察，在不激發(fā)藍(lán)光的情況下，見(jiàn)不透光的脫鈣骨支架，支架邊緣較薄處，顯微鏡微調(diào)下可見(jiàn)三維孔隙結(jié)構(gòu)。藍(lán)光激發(fā)后，熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光，呈滿天星樣，細(xì)胞在DBM支架上能較好的黏附、重疊生長(zhǎng)和增殖，細(xì)胞內(nèi)GFP有較高水平瞬時(shí)表達(dá)。見(jiàn)圖1。并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠色熒光逐漸增強(qiáng)，培養(yǎng)至14 d到最亮強(qiáng)度，培養(yǎng)至21 d后，熒光逐漸減弱至消失。

2.2 DBM和組織工程骨在SEM下的觀察及EDS分析SEM下，DBM表面粗糙，呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小不等，形狀不規(guī)則且相互交通；其孔隙直徑為300～600 μm，平均為360 μm，孔隙率達(dá)90%，見(jiàn)圖2。組織工程骨在SEM下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞在DBM網(wǎng)孔內(nèi)表面黏附、伸展良好，貼壁生長(zhǎng)，呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，疊瓦狀分布，并可見(jiàn)細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛，幾乎充滿支架孔隙。見(jiàn)圖3。體外培養(yǎng)14 d后的組織工程骨在SEM下可粗糙的生物礦化物覆蓋。用EDS儀檢測(cè)DBM和組織工程骨分別得出分析圖譜。見(jiàn)圖4。同時(shí)計(jì)算機(jī)由譜峰強(qiáng)度自動(dòng)換算為所測(cè)主要元素的相對(duì)含量。見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)顯示組織工程骨體外培養(yǎng)14 d后，表面鈣元素含量較DBM約高3.38倍，磷元素重量百分比從無(wú)增加到0.43。組織工程骨鈣磷比（Ca／P）為1.46，接近羥基磷灰石鈣磷比1.67，說(shuō)明其表面有鈣、磷沉積物產(chǎn)生，可能為磷酸鈣鹽。

表1 DBM和組織工程骨表面元素分析

3 討論

SEM／EDS在觀測(cè)樣品表面微觀形貌的同時(shí)還能進(jìn)行微觀元素分析，了解樣品微觀結(jié)構(gòu)變化與其元素組成變化的關(guān)系；這是一種高度靈敏的超微量表面分析技術(shù)，國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者已將其運(yùn)用于生物礦化材料領(lǐng)域研究［6］。EDS是目前常用的分析物質(zhì)成分的方法。當(dāng)能量大于原子電離臨界激發(fā)能量的入射電子打到樣品上時(shí)，能將原子電離，激發(fā)出特征性的X射線。一種元素發(fā)射出的特征性X射線強(qiáng)度與該元素在樣品中的含量呈正比例關(guān)系，因此利用EDS儀測(cè)量出樣品中各種特征性X射線的強(qiáng)度，再利用定量模型計(jì)算出元素的絕對(duì)含量或相對(duì)含量，可了解一種新物質(zhì)的基本成分及其理化性質(zhì)［7］。但EDS技術(shù)的應(yīng)用仍有局限性，是對(duì)樣品表面元素相對(duì)含量的分析，如相對(duì)質(zhì)量、相對(duì)原子個(gè)數(shù)，無(wú)法完全代表絕對(duì)含量變化［8］。本實(shí)驗(yàn)初步嘗試將SEM／EDS技術(shù)應(yīng)用于以DBM為支架材料體外構(gòu)建組織工程骨研究，觀測(cè)其表面微觀形貌和生物礦化。

生物礦化作用是在生物有機(jī)物質(zhì)的控制或影響下，將溶液中的離子轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔嗟V物的作用［9］。細(xì)胞是礦化的主角［10］。本實(shí)驗(yàn)將兔BMSCs與DBM復(fù)合后經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，在SEM下觀察到粗糙的生物礦化物覆蓋。通過(guò)EDS儀測(cè)量鈣、磷元素顯示，其表面為鈣、磷沉積物，鈣磷比（Ca／P）接近羥基磷灰石鈣磷比，說(shuō)明沉積物可能為磷酸鈣鹽，提示這是組織工程骨表面礦化沉積的結(jié)果。組織工程骨礦化形成過(guò)程可能與兔BMSCs體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)后其成骨分化標(biāo)志物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原蛋白、鈣結(jié)節(jié)形成有關(guān)。成骨細(xì)胞高表達(dá)ALP，促進(jìn)骨間質(zhì)礦化，其分泌的Ⅰ型膠原蛋白是構(gòu)成骨組織的蛋白支架，對(duì)骨的礦化起重要作用。分泌的膠原纖維與鈣鹽親和，形成鈣結(jié)節(jié)，促進(jìn)鈣鹽沉積［11］。骨組織的礦化過(guò)程實(shí)質(zhì)上就是磷酸鈣鹽在骨組織內(nèi)沉積的積累過(guò)程，整個(gè)骨組織礦化過(guò)程始終伴隨著鈣、磷等元素的變化。

DBM經(jīng)過(guò)脫脂、脫鈣等處理后，具有天然的立體孔隙結(jié)構(gòu)，同時(shí)DBM內(nèi)含有骨形態(tài)形成蛋白，使其具有骨誘導(dǎo)性［12］。本課題組在前期體外實(shí)驗(yàn)［5］觀察DBM的降解性能、孔隙率以及BMSCs和DBM的黏附性，證實(shí)DBM的降解曲線和BMSCs的增殖曲線相一致，具備良好的孔隙率和黏附率，提示DBM可成為比較理想的生物支架材料。在本實(shí)驗(yàn)中，制備的DBM在SEM下有較好的三維孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙直徑為300～600 μm，孔隙率達(dá)90%；EDS顯示DBM保留了適當(dāng)含量的鈣離子，可作為新生骨再鈣化的核心，為磷酸鈣的礦化沉積提供晶核。SEM和GFP標(biāo)記顯示細(xì)胞在DBM支架上黏附、伸展良好。但是DBM作為骨組織工程支架材料仍存不足之處，如機(jī)械強(qiáng)度差、降解快、供受體差異的缺點(diǎn)，以及DBM的制備方法等因素都可能影響DBM的質(zhì)量，使其應(yīng)用受到限制［13］。

GFP基因標(biāo)記是一種細(xì)胞示蹤技術(shù)，可觀察細(xì)胞在體外支架上的形態(tài)和分布［14］。重組腺病毒是一種安全、高效的基因載體，能夠高水平瞬時(shí)表達(dá)外源基因，克隆的細(xì)胞不表達(dá)目的基因［15］。本實(shí)驗(yàn)用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)兔BMSCs向成骨方向分化和增殖，使細(xì)胞能在DBM有限的三維空間內(nèi)重疊生長(zhǎng)，不發(fā)生接觸抑制。GFP標(biāo)記顯示細(xì)胞在DBM支架上能較好地黏附、重疊生長(zhǎng)和增殖。組織工程骨在體外培養(yǎng)至14 d時(shí)，綠色熒光最亮，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)GFP仍有較高水平瞬時(shí)表達(dá)。培養(yǎng)至21 d后，熒光逐漸減弱至消失，可能是GFP表達(dá)減弱和細(xì)胞大量增殖、重疊生長(zhǎng)的共同結(jié)果。因此，應(yīng)用外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程骨時(shí)，需要在目的基因較高水平瞬時(shí)表達(dá)之前植入體內(nèi)，才能發(fā)揮其生物學(xué)功能。

綜上所述，DBM體外構(gòu)建組織工程骨有非常好的生物性能。其次，利用GFP標(biāo)記結(jié)合SEM／EDS技術(shù)觀測(cè)組織工程骨的體外構(gòu)建，評(píng)價(jià)支架材料體的生物性能，以利于篩選更好的支架，為體外構(gòu)建組織工程骨積累實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Experimental study on surface microscopic morphology and biological mineralization of tissue engineering bone

Ning Yinkuan，Li Qiang，Cai Weiliang，et al
（Dept of Limb Trauma Surgery，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

ObjectiveGreen fluorescent protein（GFP）labeling，scanning electron microscope and energy dispersive spectrometer（SEM／EDS）were applied to observe surface microstructure and biological mineralization of tissue engineering bone for the purpose of evaluating the decalcified bone matrix（DBM）scaffold materials of biological properties in tissue engineering bone.MethodsThe rabbit bone-marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）were marked by Ad-GFP.Real-time growth of the cells was observed by an inverted fluorescence microscope after the osteoinductive culture on to DBM，and surface microstructure and biological mineralization of tissue engineering bone were observed by SEM／EDS.ResultsThe cells on surface of DBM had a good adhesion，overlap growth，as observed by an inverted fluorescence microscope，and a higher level of transient expression of GFP was confirmed after 14 days in vitro culture.SEM image showed that DBM had a porous structure，with pore diameter ranging from 300 to 600 μm，and a porosity rate was around 90%.The tissue engineering bone showed that cells grew adherently on the surface of DBM，matrix secretion was strong，and the DBM was covered by rough biological mineralization.X-ray photoelectron spectroscopy showed that the surface of rough biological mineralization consisted of Calcium，Phosphorus sediment，and its Calcium and Phosphorus ratio（Ca／P）was 1.46.ConclusionTissue engineering bone constructed by DBM scaffold materials in vitro has excellent biological properties，and combined application of GFP labeling，SEM and X-ray photoelectron spectroscopy is a feasible method for evaluating DBM scaffold material in tissue engineering bone.

adenovirus；green fluorescent protein；bone-marrow mesenchymal stem cells；decalcified bone matrix；X-ray photoelectron spectroscopy

R 687.34

1000－1492（2015）02－0168－05

2014－09－30接收

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：31160199）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院四肢創(chuàng)傷手外科，桂林 541001

寧寅寬，男，碩士研究生；李 強(qiáng)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：li.q12251970＠163.com