李 卓，康 煒，辛 娜，田 宇，李建華

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科 710077)

·論 著·

人AQP1-shRNA表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建與篩選*

李 卓，康 煒△，辛 娜，田 宇，李建華

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科 710077)

目的構(gòu)建針對人水通道蛋白1(AQP1)基因的shRNA表達質(zhì)粒載體，并驗證其干擾效果，為進一步探討AQP1 基因?qū)θ巳橄侔┘毎淖饔眉皺C制建立基礎(chǔ)。方法設(shè)計合成4對針對人AQP1基因不同位點的shRNA片段，通過DNA重組技術(shù)將其插入載體GV115中，構(gòu)建AQP1-shRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞，并通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)和Western blot法檢測干擾效率。結(jié)果RT-PCR法證實AQP1在乳腺癌MCF-7細胞中有表達。測序驗證表明4對靶向AQP1-shRNA表達載體均構(gòu)建成功。4組干擾載體能夠從基因和蛋白表達水平不同程度抑制AQP1表達，其中以AQP1-shRNA 4對AQP1的干擾效率最強。結(jié)論成功有效地構(gòu)建了針對人AQP1基因的shRNA重組質(zhì)粒，能夠有效抑制人乳腺癌細胞MCF-7中AQP1的表達。

乳腺腫瘤；人水通道蛋白1；shRNA

RNA干擾技術(shù)可以使目的基因表達受抑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤的分子治療研究[1]。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一族廣泛存在于生物細胞膜上的能高效特異轉(zhuǎn)運水的膜通道蛋白，在其眾多成員中目前對水通道蛋白1(aquaporin1,AQP1)的研究最為深入[2]。前期研究中筆者已證實乳腺癌組織中廣泛表達AQP1蛋白，且發(fā)現(xiàn)其表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微血管生成關(guān)系密切，提示AQP1可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[3]。本研究采用RNA干擾特異性沉默乳腺癌MCF-7細胞AQP1基因的表達，通過檢測AQP1 mRNA和蛋白的表達情況評價其抑制作用，探討RNA干擾AQP1在乳腺癌基因治療中的可行性，以期為乳腺癌的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細胞株由本院中心實驗室提供。LipofectamineTM2000及Trizol均購自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ，T4 DNA連接酶，Prime ScriptTMRT regent Kit及SYBR?Premix Ex TaqTM試劑均購自TAKARA公司。GV115 vector為上海吉凱公司產(chǎn)品。兔抗人AQP1單克隆抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人β-actin抗體購自Abcam公司。DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌MCF-7細胞，采用含10%小牛血清、100 μ/mL青/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測MCF-7細胞中AQP1基因的表達

1.2.2.1 細胞總RNA提取 對數(shù)生長期的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，采用Trizol試劑提取總RNA，用紫外分光光度計進行RNA定量，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA提取質(zhì)量。

1.2.2.2 RT-PCR RT-PCR擴增按照TaKaRa RNA PCR Kit說明書進行，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以其為模板，采用AQP1基因特異性引物進行PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠圖像分析儀觀察結(jié)果。AQP1基因引物序列為:上游，5′-GAT CAC ACA CAA CTT CAG CAA CCA-3′；下游，5′-TTC ACG CGG TCT GTG AGG TC-3′，擴增產(chǎn)物126 bp，由TAKARA公司合成。

1.2.3 構(gòu)建AQP1-shRNA重組質(zhì)粒載體

1.2.3.1 shRNA的設(shè)計 根據(jù)GeneBank中人AQP1基因的已知序列，選擇其基因編碼區(qū)的4個19nt的寡核苷酸序列作為靶點(表1)，設(shè)計并合成與之對應(yīng)的cDNA模板序列，分別命名為AQP1-1，AQP1-2，AQP1-3，AQP1-4(表2)，由上海吉凱公司合成，同時以一條無意序列作為陰性對照。

1.2.3.2 shRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定 將合成的目的基因片段稀釋成100 μmol/L，各取5 μL配對混合后于PCR儀中95 ℃，5 min，室溫靜置20 min，形成雙鏈DNA片段。同時，使用AgeⅠ和EcoRⅠ對GV115載體于37 ℃，4 h進行酶切。將干擾片段分別與線性化的GV115質(zhì)粒表達載體進行連接，16 ℃反應(yīng)過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，于含氨芐霉素抗性的LB培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落，擴增提取質(zhì)粒，行測序鑒定。分別命名為AQP1-shRNA1、AQP1-shRNA2、AQP1-shRNA3和AQP1-shRNA4，陰性對照命名為Con-shRNA。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整濃度為1×105個/孔，按每孔2 mL加入6孔板中，待細胞對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)染。實驗分6組，分別為空白對照組、對照shRNA組和轉(zhuǎn)染組(4個AQP1-shRNA組)，每組設(shè)3復(fù)孔。具體操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000試劑說明書進行。每孔加入4 μg質(zhì)粒，將其與脂質(zhì)體按比例組成的復(fù)合物逐滴加入6孔板中，輕輕晃動使其分布均勻。正常對照組每孔加入等體積的RPMI 1640培養(yǎng)基(不含血清和抗生素)。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，之后更換含有血清的新鮮培養(yǎng)基，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 shRNA 對MCF-7細胞AQP1表達抑制率的檢測

1.2.5.1 RT-PCR法檢測AQP1 mRNA的表達 轉(zhuǎn)染48 h后，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑進行RT-PCR，20 μL反應(yīng)體系，包括10 μL 2×SYBR?Premix Ex TaqTM，正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，雙蒸水6.8 μL。各設(shè)3個平行復(fù)孔，使用ABI 7500快速RT-PCR儀，反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 3 s、60℃ 30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和溶解曲線。AQP1基因所采用的PCR反應(yīng)引物與1.2.2.2 RT-PCR引物序列相同。此外，同時引入β-actin基因作為內(nèi)參，引物序列為:上游，5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′；下游，5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGG A-3′，由TAKARA公司合成。AQP1的相對表達量采用2-ΔΔCT法進行計算，并用GraphPad Prism 5軟件進行分析和繪圖。

1.2.5.2 Western blot法檢測AQP1蛋白的表達 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取細胞總蛋白，采用BCA法定量。配制12%的凝膠進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜后分布加入一抗(兔抗人AQP1抗體1∶1 000稀釋，兔抗人β-actin抗體1∶2 000稀釋)，4 ℃過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)，采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行結(jié)果掃描。

2 結(jié) 果

2.1 AQP1在乳腺癌MCF-7細胞中有表達 采用RT-PCR法，所得產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，可以看到126 bp處有明顯條帶，證實AQP1在乳腺癌細胞MCF-7中有表達，見圖1。

M:DL2000 DNA Marker;1:MCF-7細胞。

圖1 RT-PCR檢測人乳腺癌MCF-7細胞中的AQP1 mRNA

2.2 重組質(zhì)粒鑒定及轉(zhuǎn)染率檢測 構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體AQP1-shRNA經(jīng)DNA測序比對，證實插入序列與所設(shè)計的DNA序列完全一致，無突變堿基，表明靶向AQP1基因的shRNA質(zhì)粒表達載體構(gòu)建成功，見圖2。重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染6 h后，倒置相差熒光顯微鏡下即可觀察到MCF-7細胞內(nèi)逐漸出現(xiàn)綠色熒光，48 h時熒光強度最強，根據(jù)轉(zhuǎn)染細胞的熒光判斷其轉(zhuǎn)染效率約為50%，見圖3。

表1 APQ1靶序列信息

表2 AQP1-shRNA序列信息

A:AQP1-shRNA1組;B:AQP1-shRNA2組;C:AQP1-shRNA3組;D:AQP1-shRNA4組。

圖2 AQP1-shRNA重組質(zhì)粒測序峰圖

圖3 熒光顯微鏡觀察AQP1-shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后的MCF-7細胞(×200)

1:空白對照組；2:對照shRNA組；3:AQP1-shRNA1組；4:AQP1-shRNA2組；5:AQP1-shRNA3組；6:AQP1-shRNA4組；*:P<0.05，與空白對照組比較。

圖4 AQP1-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后AQP1 mRNA的表達量

2.3 AQP1-shRNA對MCF-7細胞中AQP1 mRNA水平的抑制作用 RT-PCR檢測結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)染組和對照組均有AQP1和內(nèi)參β-actin的特異性擴增，擴增曲線平滑，溶解曲線特異。經(jīng)2-ΔΔCT法分析，轉(zhuǎn)染組細胞的AQP1 mRNA表達水平呈不同程度降低，抑制率分別為32.37%、36.63%、53.20%和70.54%，見圖4。

2.4 AQP1-shRNA對MCF-7細胞中的AQP1蛋白表達的抑制作用 Western blot法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，4組AQP1-shRNA轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞中的AQP1蛋白表達量均不同程度減低，分別為0.70±0.06、0.68±0.03、0.45±0.06和0.29±0.04，其中以AQP1-shRNA4的表達量最低，見圖5。

A:Western blot;B:蛋白表達量。1:空白對照組；2:對照shRNA組；3:AQP1-shRNA1組；4:AQP1-shRNA2組；5:AQP1-shRNA3組；6:AQP1-shRNA4組；*:P<0.05，與空白對照組比較。

圖5 AQP1-shRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后AQP1蛋白表達量

3 討 論

近年來大量研究證實，機體內(nèi)廣泛存在著特異性水通道蛋白家族(aquaporins,AQPs)[4-5]，目前已從動物組織中鑒定出13種水通道蛋白亞型(AQP0～12)，其中對AQP1的研究最為深入[2,6]。AQP1分布廣泛，具有特異轉(zhuǎn)運水的功能。研究發(fā)現(xiàn)，AQP1可表達于多種腫瘤組織中，它可能與腫瘤細胞的起源、生長及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[7-9]。AQP1最早發(fā)現(xiàn)與多發(fā)性骨髓瘤微血管形成有關(guān)[10]，Saadoun等[11]在微血管內(nèi)皮細胞中也發(fā)現(xiàn)AQP1的高度表達，推測AQP1也可能與腫瘤的血管新生、發(fā)展有關(guān) 。有研究顯示，AQP1還參與細胞周期的調(diào)控，在細胞無限制復(fù)制過程中發(fā)揮著一定作用。正因為AQP1與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，目前已成為眾多學(xué)者研究的熱點。但有關(guān)AQP1在乳腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中的作用及對乳腺癌細胞生長的影響目前國內(nèi)外尚少有報道。前期研究中，筆者采用免疫組織化學(xué)法，對106例乳腺癌組織及作為對照的20例癌旁正常組織中AQP1表達情況進行了檢測，結(jié)果表明，乳腺癌組織中廣泛表達AQP1蛋白，且發(fā)現(xiàn)其表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微血管生成關(guān)系密切，提示AQP1可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[3]。

RNA干擾技術(shù)，是通過雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后使相關(guān)基因表達減少或不表達的過程，能夠使目的基因穩(wěn)定沉默且對其他正?；虻谋磉_不造成影響，該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療的研究領(lǐng)域[1,12-13]。采用RNAi技術(shù)沉默靶基因，探討其在腫瘤細胞中的表達情況及其對腫瘤細胞生物學(xué)特性的影響，并觀察其抗腫瘤作用，對研究腫瘤的基因治療具有重要意義。

本研究采用RT-PCR法證實AQP1 mRNA在人乳腺癌MCF-7細胞中有表達，再次印證了前期臨床組織學(xué)實驗的結(jié)果[3]。在此基礎(chǔ)上，筆者針對AQP1 mRNA 的不同靶點設(shè)計并合成了4個shRNA，構(gòu)建了靶向AQP1的shRNA重組質(zhì)粒，經(jīng)測序分析證實載體構(gòu)建成功。將4個shRNA重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞后，通過檢測AQP1 mRNA和蛋白表達水平評價該載體對AQP1表達的抑制作用。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，4個AQP1-shRNA轉(zhuǎn)染后均可不同程度降低AQP1 mRNA和蛋白表達水平，其中以AQP1-shRNA4的沉默效應(yīng)最為顯著。據(jù)此，結(jié)合前期回顧性臨床研究結(jié)果，筆者推測抑制AQP1基因的表達有可能會抑制腫瘤的血管新生及其通透性，并抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這為乳腺癌的基因治療開辟了新的思路。

然而，本研究的局限性是，關(guān)于AQP1蛋白表達量降低對乳腺癌MCF-7細胞生物學(xué)行為的影響，及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性變化方面的影響，還有待進一步驗證。

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Construction and screening of human AQP1 shRNA expression vectors*

LiZhuo,KangWei△,XinNa,TianYu,LiJianhua

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710077,China)

Objective To construct and screen effective shRNA expression vectors targeting human AQP1 gene,and evaluate the interference efficiency of the AQP1 shRNA recombinant plasmids,thus provide basis for further exploration on the effect and mechanism of AQP1 gene on human breast cancer cells.MethodsFour pairs of shRNA sequences targeting human AQP1 gene were designed and synthesized,and then inserted into the GV115 vector.AQP1 shRNA and control shRNA plasmids were transfected into human breast cancer MCF-7 cells.The expression of AQP1 mRNA and protein were detected by real time PCR(RT-PCR) and Western blot to evaluate the interfering efficiency.ResultsRT-PCR demonstrated that AQP1 was expressed in human breast cancer MCF-7 cells.Sequencing showed that the shRNA vectors targeting AQP1 were successfully constructed.48 h after the AQP1 shRNA transfection,AQP1 mRNA and protein expression levels in MCF-7 cells were reduced to a significant degree,and the AQP1 shRNA 4 plasmid vector could inhibit the AQP1 most efficiently.ConclusionThe AQP1 shRNA recombinant plasmids vectors were successfully constructed and can significantly inhibit the expression of AQP1 in MCF-7 human breast cancer cells.

breast neoplasms;aquaporin1;shRNA

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.003

陜西省教育廳專項科研計劃項目(12JK0768)。

:李卓(1982-)，在職博士，主治醫(yī)師，講師，主要從事腫瘤生物治療研究工作。△

，Tel:(029)84277601；E-mail:kang_wei2008@163.com。

R73-36+2

A

1671-8348(2015)30-4183-04

2015-03-01

2015-05-23)