石維坤 李艷 李中正

【摘要】目的：觀察苗醫(yī)推拿治療緩解期兒童哮喘的臨床療效及對免疫平衡的影響，并初步探討其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。方法：30例健康兒童為健康對照組。30例哮喘緩解期兒童為推拿組，比較推拿前后兒童哮喘控制測試（C-ACT）評分，檢測血清Th1、Th2及Th17的代表性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量及外周血CD4+T細(xì)胞的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）及組蛋白去乙?；福℉DAC）的活性。結(jié)果：苗醫(yī)推拿總有效率達(dá)9334%，可升高血清IFN-γ水平，同時(shí)降低IL-4及IL-17水平，并抑制HAT活性，同時(shí)增強(qiáng)HDAC活性（均P<005）。結(jié)論：苗醫(yī)推拿治療緩解期兒童哮喘療效肯定，能有效調(diào)節(jié)免疫平衡。組蛋白乙酰化修飾等表觀遺傳學(xué)機(jī)制可能在其中發(fā)揮了一定作用。

【關(guān)鍵詞】湘西劉氏小兒推拿;哮喘;IFN-γ;IL-4;IL-17;表觀遺傳學(xué)

【中圖分類號】R29【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2014）07-0011-02

Abstract：

Keywords：

兒童支氣管哮喘是目前臨床常見的慢性呼吸道疾病，有反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的特點(diǎn)[1]。經(jīng)典理論認(rèn)為Th1型免疫反應(yīng)減弱而Th2型免疫反應(yīng)異常增強(qiáng)在哮喘的發(fā)病過程中起到重要作用，即Th1/Th2細(xì)胞失衡學(xué)說[2-3];近年來發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞/Treg（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的免疫失衡也是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一[4]。我國已故著名推拿大師劉開運(yùn)教授開創(chuàng)了獨(dú)具特色的苗醫(yī)“小兒推拿”[5]，稱為湘西劉氏小兒推拿流派，治療小兒肺、脾系疾病療效最為顯著[6]。本研究對比治療前后血清Th1、Th2及Th17的代表性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量，觀察苗醫(yī)推拿對緩解期哮喘兒童免疫平衡的影響;并通過檢測外周血CD4+T細(xì)胞的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）及組蛋白去乙?；福℉DAC）的活性，初步探討其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。本研究得到了吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查和批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：20130002）。

1材料與方法

11病例資料收集吉首大學(xué)附屬中醫(yī)院（湘西土家族苗族自治州民族中醫(yī)院）門診病例30例，作為推拿組，其中男13例，女17例;土家族20例，苗族10例;年齡最小5歲，最大6歲半，平均645±118歲;病程最短6個(gè)月，最長4年，平均332±156年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡5至7歲，性別不限，民族不限;②符合緩解期兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];③除哮喘外無其他疾病;④患兒家長或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。另從健康管理中心隨機(jī)收集30例健康兒童為健康對照組，要求年齡5至7歲，無過敏病史，近期無呼吸道感染史，近期未使用藥物;其中男11例，女19例;土家族18例，苗族12例;年齡最小5歲，最大7歲，平均674±148歲。2組兒童在性別、民族構(gòu)成、年齡等方面差異均無顯著性（P>005）。

12治療方法推拿組治法為：補(bǔ)益脾肺、固腎納氣?；純好嫦蜥t(yī)生站立，取其左側(cè)肢體施術(shù)，用姜汁作推拿介質(zhì)，具體推治如下：常例手法（開天門、推坎宮、推太陽、按總筋、分陰陽各30次）。補(bǔ)腎經(jīng)400次，補(bǔ)肺經(jīng)350次，補(bǔ)脾經(jīng)300次，清肝經(jīng)250次，揉外勞宮100次，揉板門120次，揉按肺俞150次，捏脊5遍，推膻中120次，揉中脘、丹田各150次，揉按足三里120次，按肩井3次。

女童由女醫(yī)師進(jìn)行推拿治療。每周治療3次（具體時(shí)間由兒童的監(jiān)護(hù)人決定），共治療3個(gè)月。治療前后分別采集哮喘患兒晨起空腹靜脈血10ml。健康對照組兒童入組后也采集晨起空腹靜脈血10ml。

13觀察指標(biāo)

131兒童哮喘控制測試（C-ACT）[8]治療前后各評估一次。得分≥25分為哮喘臨床控制，20～24分為部分控制，<20分為未控制。

132細(xì)胞因子含量檢測IFN-γ、IL-4、IL-17試劑盒購自武漢博士德公司，酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek，ELX-800），采用ELISA法檢測血清細(xì)胞因子的含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

133HAT、HDAC活性檢測淋巴細(xì)胞分離液購自上海研謹(jǐn)公司，分選MACS微珠（CD4）購自德國Miltenyi公司，HAT、HDAC活性試劑盒購自美國Biovision公司。對采集的靜脈血采用密度梯度離心法（Ficoll法）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠進(jìn)一步分離CD4+T細(xì)胞，ELISA法檢測吸光度。用試劑盒中一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算去乙酰化賴氨酸的濃度，來代表HAT、HDAC的活性。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

14統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 140統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

21推拿組臨床療效臨床控制11例（3667%），部分控制17例（5667%），未控制2例（667%），總有效率28例（9334%）。

22苗醫(yī)推拿前后血清細(xì)胞因子對比

表1苗醫(yī)推拿前后血清IFN-γ、IL-4、IL-17

對比（x±s，ng/L）

nIFN-γIL-4IL-17推拿組治療前302906±283△15347±905△529±077△推拿組治療后305850±409#7290±1202#337±049#健康對照組305963±4867127±1330344±042注：與健康對照組比較，△P <005;與推拿治療前比較，#P <005表1結(jié)果提示：緩解期哮喘患兒血清IFN-γ、IL-4及IL-17顯著高于健康兒童（P<005）;苗醫(yī)推拿治療后與治療前比較，血清IFN-γ顯著升高，IL-4及IL-17顯著降低（均P<005），與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>005）。

23苗醫(yī)推拿前后外周血CD4+T細(xì)胞HAT、HDAC活性對比

表2苗醫(yī)推拿前后外周血CD4+T細(xì)胞HAT、HDAC

活性對比（x±s，μmoL/L）

nHAT活性HDAC活性推拿組治療前301767±245△457±161△推拿組治療后301140±283#746±319#健康對照組301106±270793±290注：與健康對照組比較，△P <005;與推拿治療前比較，#P <005。表2結(jié)果是示：與健康對照組比較，緩解期哮喘患兒外周血CD4+T細(xì)胞HAT活性增強(qiáng)，HDAC活性減弱（均P<005）;苗醫(yī)推拿治療后與治療前比較，HAT活性降低，HDAC活性增強(qiáng)（均P<005），與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>005）。

3討論

湘西劉氏小兒推拿流派是國內(nèi)著名的小兒推拿流派之一[6]，推拿名家嚴(yán)雋陶教授就推拿學(xué)源流特別指出“魯東湘西的兒科推拿”各具特色[9]。哮喘患兒緩解期主要表現(xiàn)為肺脾腎三臟的虛損，苗醫(yī)推拿治療緩解期哮喘以調(diào)治臟腑、增強(qiáng)體質(zhì)、預(yù)防復(fù)發(fā)為目的，體現(xiàn)了中醫(yī)“未病先防、既病防變”的治未病理念。推治過程中開天門、推坎宮、推太陽、按總筋、分陰陽各30次為本流派常例“開竅”手法;推治五經(jīng)根據(jù)五行生克、助制[10]之理，采用“補(bǔ)三抑一法”，即主補(bǔ)腎經(jīng)，兼補(bǔ)肺經(jīng)、次補(bǔ)脾經(jīng)、稍清肝經(jīng)，重在補(bǔ)腎、肺、脾三經(jīng)治其本，斷其伏痰，清肝經(jīng)以防肝旺乘脾侮肺;肺俞、膻中寬胸理氣，宣肺化痰;揉中脘、板門、足三里，捏脊健脾化濕;揉丹田、外勞宮溫補(bǔ)陽氣;按肩井“關(guān)竅”。從臨床實(shí)踐來看，苗醫(yī)推拿能有效控制哮喘，預(yù)防復(fù)發(fā)（總有效率達(dá)9334%）。

IL-4與哮喘氣道重塑的發(fā)生存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)性;IFN-γ有利于Th1細(xì)胞的分化，而抑制Th2的分化，達(dá)到Th1/Th2的平衡狀態(tài)，從而使哮喘患者的氣道炎癥得到控制[11];IL-17在哮喘的炎癥中發(fā)揮重要作用，表達(dá)水平與哮喘發(fā)作程度呈正相關(guān)[12]。本研究印證了緩解期哮喘兒童Th1/Th2平衡紊亂、Th1及Th17應(yīng)答增強(qiáng)，并證實(shí)了苗醫(yī)推拿能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，下調(diào)IL-17含量（均P<005）。

表觀遺傳學(xué)的改變在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[13]。表觀遺傳學(xué)研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)調(diào)控，主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化與非編碼調(diào)節(jié)性RNA調(diào)控。組蛋白修飾包括乙?；?、甲基化和磷酸化等，其中乙?；叭ヒ阴；揎椦芯枯^多，是動態(tài)的可逆的修飾。HAT促進(jìn)組蛋白乙?；拖嚓P(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而HDAC促進(jìn)組蛋白去乙?；?，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。哮喘患者支氣管肺泡灌洗液巨噬細(xì)胞及活檢肺組織標(biāo)本中HAT活性增強(qiáng)伴隨HDAC活性降低[14]，外周血單個(gè)核細(xì)胞也存在同樣的改變[15]。本研究結(jié)果顯示，苗醫(yī)推拿治療3個(gè)月后，患兒外周血CD4+T細(xì)胞HAT活性顯著降低而HDAC活性顯著升高（均P<005），說明苗醫(yī)推拿可抑制HAT活性，增強(qiáng)HDAC活性，減弱組蛋白乙?；@可能是其調(diào)節(jié)哮喘患兒免疫平衡的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，但能否長期保持這種表觀遺傳學(xué)狀態(tài)，還需要進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：20140106）