李風(fēng)娟，劉婉璐，方元元，趙 月，王昌祿

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

高血壓是引發(fā)心腦血管疾病的主要風(fēng)險因素之一，人體的腎素–血管緊張素系統(tǒng)是一種重要的體液調(diào)節(jié)機制，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)是該系統(tǒng)的一個關(guān)鍵酶，它可以通過催化無活性的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有強血管收縮活性的血管緊張素Ⅱ，并降解具有血管舒張活性的血管舒緩激肽，從而致使血壓升高[1].所以，對ACE 活性的抑制被認為是治療高血壓的一種有效手段.由于化學(xué)合成的ACE 抑制劑類降壓藥物存在咳嗽等副作用，具有ACE 抑制活性的食品或食源性成分受到廣泛關(guān)注.

目前已發(fā)現(xiàn)的食源性ACE 抑制劑大多數(shù)為活性肽類物質(zhì)[2–3]，發(fā)酵大豆食品的ACE 抑制活性也與大豆蛋白質(zhì)被微生物蛋白酶降解所生成的多肽密切相關(guān)，如從日本腐乳中分離得到的Trp-Leu 和Ile-Phe-Leu[4]、從高溫快速發(fā)酵豆醬中得到的Leu-Val-Gln-Gly-Ser[5]等.另一方面，考察發(fā)酵過程中產(chǎn)品的ACE抑制活性的變化，進而有效地控制發(fā)酵過程，對于降血壓功能性食品的生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用指導(dǎo)意義.本研究采用一株枯草芽孢桿菌制備發(fā)酵大豆，旨在研究發(fā)酵過程中ACE 抑制活性的變化規(guī)律，并從大豆蛋白質(zhì)的降解及多肽的生成角度進行分析，以期為應(yīng)用該菌株研發(fā)具有潛在降壓活性的發(fā)酵大豆食品提供理論依據(jù).

1 原料與方法

1.1 原料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SY 菌種從醬曲中分離得到.大豆購自吉林農(nóng)科院大豆研究中心.

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE，0.1,U，源于兔肺)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、鄰苯二甲醛(OPA)、谷胱甘肽和 2，4，6–三硝基苯磺酸(TNBS)購自美國Sigma 公司，酵母提取物和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，其他試劑均為分析純.

1.2 實驗儀器

EYELA KCL–2000 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，日本東京理化公司；ALPHA 2–4 LD plus 型真空冷凍干燥機，德國Christ 公司；Avanti J–26 XP 型冷凍離心機，美國Beckman Coulter 公司；RF–5300PC 型熒光分光光度計，日本島津公司；Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；Agilent 8453 型紫外-可見分光光度計，美國安捷倫公司.

1.3 樣品的制備方法

1.3.1 發(fā)酵大豆的制備

將0.5,g 酵母提取物、1.0,g 胰蛋白胨和1.0,g NaCl 混勻，加100,mL 蒸餾水溶解，用HCl 調(diào)pH 至7.0，滅菌20,min，制備LB 液體培養(yǎng)基.

從保藏斜面上挑取枯草芽孢桿菌SY 接于LB 液體培養(yǎng)基(50,mL/250,mL 三角瓶)，于 37,℃、150,r/min 搖床培養(yǎng)12,h，得到種子液，備用.

挑選顆粒飽滿、無蟲害的大豆，清洗干凈，用3倍質(zhì)量的水在室溫下浸泡過夜，然后將水瀝干后定量盛于竹屜中，于121,℃蒸40,min.蒸制大豆冷卻后接種枯草芽孢桿菌SY 種子懸浮液，接種量為1,mL/100,g，攪拌均勻，移入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，于37,℃、相對濕度90%的條件下進行培養(yǎng)，并定時取樣.

1.3.2 發(fā)酵大豆水提物的制備

將上述各發(fā)酵階段所獲取的發(fā)酵大豆樣品置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥，磨碎.準確稱取0.5,g凍干粉，加入5,mL 蒸餾水，充分振蕩混勻.超聲波提取 5,min 后于室溫下?lián)u床提取 1,h，再沸水浴15,min.將所得樣液6,500,r/min 離心10,min，上清液以0.45,μm 膜過濾，收集濾液，即為樣品水提物，將其濃度標(biāo)記為100,mg/mL.

1.4 ACE抑制活性的測定

對ACE 抑制活性的測定參照Li 等[6]的評價方法.將樣品水提物適當(dāng)稀釋，以96 孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器.將15,μL 樣液(對照反應(yīng)液中以蒸餾水代替)與30,μL 4.66,mmol/L 的HHL 溶液(溶于0.6,mol/L NaCl–0.4,mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 8.5)混合，然后加入30,μL 12.5,mU/mL 的ACE 酶液(樣品反應(yīng)液和對照反應(yīng)液的空白以蒸餾水代替)，在微孔板混合器上混勻后于 37,℃反應(yīng) 1,h.加入 120,μL 1.2,mol/L NaOH 溶液終止酶反應(yīng)，接著加入30,μL 2%的OPA溶液(溶于甲醇)，混勻，室溫下靜置20,min 后加入30,μL 6,mol/L 的HCl 溶液終止衍生反應(yīng).將反應(yīng)液稀釋30 倍后測定熒光吸收強度，條件如下：激發(fā)波長340,nm，發(fā)射波長455,nm，狹縫寬度5,nm.樣液的ACE 抑制率計算公式為

式中：I1表示樣品反應(yīng)液即存在ACE 抑制劑時的熒光吸收強度；I2表示對照反應(yīng)液即無ACE 抑制劑時的熒光吸收強度.

ACE 抑制率越大，說明抑制劑在該濃度條件下抑制ACE 活性的能力越強.以抑制劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，抑制率為50%時抑制劑的濃度即為半抑制濃度(IC50)，IC50越小，說明抑制劑對ACE 活性的抑制能力越強.

1.5 中性蛋白酶活性的測定

稱取1.0,g 樣品加入10,mL 蒸餾水，在150,r/min振蕩提取1,h 后，于4,℃、6,500,r/min 離心10,min，轉(zhuǎn)移上清液.在殘渣中加入10,mL 蒸餾水，混勻后再次離心.將兩次離心上清液合并作為酶提取液.

中性蛋白酶活性的測定參照 Yang 等[7]的方法.先取1,mL 酶液與1,mL 2%的酪蛋白溶液(溶于0.2,mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH,7.5)分別于40,℃保溫，10,min 后將兩者混合，再在40,℃精確反應(yīng)30,min，然后加入2,mL 0.4,mol/L 三氯乙酸(TCA)溶液終止反應(yīng)，6,500,r/min 離心10,min，過濾.另取1,mL 酶液，先加入TCA 溶液，然后加入酪蛋白溶液，于室溫下6,500,r/min 離心10,min，過濾，濾液作為空白，于275,nm 測定濾液的吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，計算出當(dāng)吸光度為1 時酪氨酸的質(zhì)量(μg)，即為吸光常數(shù)K 值.將上述條件下1,mL 酶液在1,min 內(nèi)釋放出相當(dāng)于1,μg 酪氨酸的酶活定義為1 個酶活單位.

1.6 多肽含量的測定

多肽含量的測定參照Church 等[8]的方法.OPA試劑的配制如下：將50,mL 0.1,mol/L 的四硼酸鈉溶液、5,mL 20%的SDS 溶液、0.5,mL β–巰基乙醇及2.5,mL 5%的OPA 溶液(溶于甲醇)混合后，用蒸餾水定容至100,mL.將樣品水提物適當(dāng)稀釋，取15,μL 置于酶標(biāo)板小孔中，加入300,μL OPA 試劑，混勻，室溫下靜置反應(yīng)10,min，用酶標(biāo)儀于340,nm 測定吸光度.以谷胱甘肽作標(biāo)準曲線.

1.7 游離氨基含量的測定

游離氨基含量的測定參照 Haynes 等[9]的方法.將樣品水提物適當(dāng)稀釋，取0.2,mL，加入1,mL 0.212,5,mol/L 磷酸緩沖液(pH 8.2)，然后按一定時間間隔依次加入1.0,mL 0.1%的TNBS 溶液(對照組為蒸餾水)，50,℃水浴中避光反應(yīng)1,h.按相同時間間隔依次加入4,mL 0.1,mol/L 的HCl 溶液.靜置30,min后取300,μL 置于酶標(biāo)板小孔中，用酶標(biāo)儀于340,nm處測定反應(yīng)液的吸光度.以亮氨酸作標(biāo)準曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中樣品的ACE抑制活性的變化

發(fā)酵過程中樣品的ACE 抑制活性的變化如圖1所示(ND 表示未檢測出ACE 抑制活性)，所測樣品的質(zhì)量濃度為0.667,mg/mL.在該濃度條件下，未發(fā)酵的樣品沒有表現(xiàn)出ACE 抑制活性，發(fā)酵12,h 的樣品的ACE 抑制率達到70%，而發(fā)酵24,h 樣品的ACE抑制率降至44%，在隨后的發(fā)酵期間保持平穩(wěn).圖2為發(fā)酵12,h 的樣品在不同濃度下的ACE 抑制活性，呈現(xiàn)濃度依賴型，根據(jù)擬合曲線得到其IC50值為0.312,mg/mL.

在發(fā)酵初期樣品中ACE 抑制劑大量快速生成，這也是所用枯草芽孢桿菌快速增殖的過程，而隨著發(fā)酵的充分進行，已生成的ACE 抑制劑被最大程度地消耗或轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致活性降低并趨于穩(wěn)定.在Zhang等[10]的研究中指出，用埃及曲霉(Aspergillus egypticus)發(fā)酵制備豆豉時，在15,d 的發(fā)酵過程中，樣品的ACE 抑制活性先快速后持續(xù)緩慢增加；而用五通橋毛霉(Mucor wutungkiao)發(fā)酵制備豆豉[11]及用雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)發(fā)酵制備腐乳[12]時發(fā)現(xiàn)，樣品的ACE 抑制活性均呈現(xiàn)出初期升高而后降低的趨勢，與本研究的結(jié)果相似.據(jù)此推斷，對于這些不同類型的發(fā)酵大豆食品，其制備過程中ACE 抑制活性的變化會受到發(fā)酵原料及發(fā)酵菌種等的影響，而對于本研究所用的枯草芽孢桿菌SY 而言，為保持發(fā)酵大豆良好的ACE 抑制活性，應(yīng)嚴格控制發(fā)酵進程.同時，這些研究[10–12]均指出多肽類物質(zhì)對樣品的ACE 抑制活性起著重要的作用，所以本研究也將重點從枯草芽孢桿菌SY 發(fā)酵大豆過程中蛋白質(zhì)降解的角度對樣品的ACE 抑制活性的變化進行分析.

圖1 發(fā)酵過程中樣品的ACE抑制活性的變化Fig.1 Changes of ACE inhibitory activity during fermentation

圖2 發(fā)酵12 h的樣品在不同濃度下的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibition versus concentration of the sample fermented 12 h

2.2 發(fā)酵過程中樣品的中性蛋白酶活性的變化

發(fā)酵過程中樣品的中性蛋白酶活性的變化見圖3(ND 表示未檢測出中性蛋白酶活性).發(fā)酵12,h 時枯草芽孢桿菌SY 分泌的中性蛋白酶活力(以干質(zhì)量計)為294,U/g，36,h 時增至718,U/g，在隨后的發(fā)酵期間變化不大.

圖3 發(fā)酵過程中樣品的中性蛋白酶活性的變化Fig.3 Changes of neutral protease activity during fermentation

發(fā)酵大豆食品的ACE 抑制活性多歸因于蛋白質(zhì)被微生物蛋白酶降解所產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)[4–5]，枯草芽孢桿菌SY 增殖過程中分泌的蛋白酶作用于大豆蛋白質(zhì)使其降解為小分子多肽.在前36,h，蛋白酶活力持續(xù)增加，然而，樣品的ACE 抑制活性已在此階段由高值逐漸降低，說明蛋白質(zhì)的適度降解對于產(chǎn)品保持較高的ACE 抑制活性具有積極的影響，而發(fā)酵后期蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生的進一步降解則會造成ACE抑制活性的損失.

2.3 發(fā)酵過程中樣品的多肽及游離氨基含量的變化

發(fā)酵過程中樣品的多肽及游離氨基含量的變化分別見圖4 和圖5.由此可見兩者具有相似的變化趨勢，至發(fā)酵48,h，多肽含量(以干質(zhì)量計)持續(xù)升高至30.57,g/100,g，至發(fā)酵72,h，游離氨基含量(以干質(zhì)量計)持續(xù)增至1.00,mmol/g，然后逐漸趨于穩(wěn)定.結(jié)合中性蛋白酶活性的變化可以看出，在高活力的蛋白酶的作用下，大豆蛋白質(zhì)逐漸被充分降解，這進一步說明了樣品ACE 抑制活性的損失與蛋白質(zhì)的過度降解有關(guān).Chiang 等[13]在研究中用5 種不同的蛋白酶直接作用于大豆分離蛋白，發(fā)現(xiàn)用風(fēng)味蛋白酶所得酶解物的水解度最高卻表現(xiàn)出最低的ACE 抑制活性，指出了高蛋白水解程度不一定保證高ACE 抑制活性.

圖4 發(fā)酵過程中樣品的多肽含量的變化Fig.4 Changes of peptide content during fermentation

圖5 發(fā)酵過程中樣品的游離氨基含量的變化Fig.5 Changes of amount of free amino groups during fermentation

多肽與ACE 的結(jié)合能力取決于其結(jié)構(gòu)特點，在發(fā)酵初期所生成的多肽的結(jié)構(gòu)更有利于其與ACE 的活性位點結(jié)合進而發(fā)揮抑制作用，而隨著發(fā)酵的進行，這些有利的結(jié)構(gòu)特點可能隨著多肽的進一步降解被逐漸打破，降低了其與ACE 活性位點的有效結(jié)合而減弱了對ACE 的抑制作用，從而導(dǎo)致樣品整體ACE 抑制活性的下降.這種變化也同樣發(fā)生在用M.,wutungkiao 發(fā)酵制備豆豉[11]及用A.elegans 發(fā)酵制備腐乳[12]的后酵過程中，樣品中的多肽含量逐漸增加，而ACE 抑制活性卻出現(xiàn)損失.所以，為獲得具有良好ACE 抑制活性的產(chǎn)品，控制蛋白質(zhì)的適度降解具有重要的意義.

3 結(jié)論

采用枯草芽孢桿菌SY 發(fā)酵大豆的過程中，樣品的ACE 抑制活性在前期迅速增加，然后降低并保持平穩(wěn)，發(fā)酵12,h 樣品在質(zhì)量濃度為0.667,mg/mL 時的ACE 抑制率為70%，其IC50值為0.312,mg/mL.中性蛋白酶活力在前36,h 迅速增加達到718,U/g，多肽及游離氨基的含量也逐漸增加并趨于穩(wěn)定.蛋白質(zhì)的適度降解有利于高ACE 抑制活性多肽的生成，而過度降解則造成產(chǎn)品活性的損失.在控制發(fā)酵進程的條件下，枯草芽孢桿菌SY 有望應(yīng)用于發(fā)酵大豆食品的生產(chǎn)而獲得具有潛在調(diào)節(jié)血壓作用的產(chǎn)品，同時，還需對產(chǎn)品中的ACE 抑制肽進行結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系的深入分析.

［1］Ondetti M A，Cushman D W.Inhibition of the reninangiotensin system.A new approach to the therapy of hypertension[J].Journal of Medicinal Chemistry，1981，24(4)：355–361.

［2］Miguel M，Contreras M M，Recio I，et al.ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J].Food Chemistry，2009，112(1)：211–214.

［3］Quist E E，Phillips R D，Saalia F K.Angiotensin converting enzyme inhibitory activity of proteolytic digests of peanut(Arachis hypogaea L.)flour[J].LWT-Food Science and Technology，2009，42(3)：694–699.

［4］Kuba M，Tanaka K，Tawata S，et al.Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides isolated from tofuyo fermented soybean food[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2003，67(6)：1278–1283.

［5］Rho S J，Lee J S，Chung Y I，et al.Purification and identification of an angiotensin Ι-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract[J].Process Biochemistry，2009，44(4)：490–493.

［6］Li F J，Yin L J，Lu X，et al.Changes in angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activities during the ripening of douchi(a Chinese traditional soybean product)fermented by various starter cultures[J].International Journal of Food Properties，2010，13(3)：512–524.

［7］Yang J K，Shih I L，Tzeng Y M，et al.Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes[J].Enzyme and Microbial Technology，2000，26(5)：406–413.

［8］Church F C，Swaisgood H E，Porter D H，et al.Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J].Journal of Dairy Science，1983，66(6)：1219–1227.

［9］Haynes R，Osuga D T，F(xiàn)eeney R E.Modification of amino groups in inhibitors of proteolytic Enzymes[J].Biochemistry，1967，6：541–547.

［10］Zhang J H，Eizo T，Ding C H，et al.Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides in douchi，a Chinese traditional fermented soybean product[J].Food Chemistry，2006，98(3)：551–557.

［11］Wang H，Li Y，Cheng Y，et al.Effect of the Maillard reaction on angiotensin I-converting enzyme(ACE)-inhibitory activity of douchi during fermentation[J].Food and Bioprocess Technology，2011，6(1)：297–301.

［12］Ma Y，Cheng Y，Yin L，et al.Effects of processing and NaCl on angiotension I-converting enzyme inhibitory activity and γ-aminobutyric acid content during sufu manufacturing[J].Food and Bioprocess Technology，2013，6(7)：1782–1789.

［13］Chiang W D，Tsou M J，Tsai Z Y，et al.Angiotensin Iconverting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J].Food Chemistry，2006，98(4)：725–732.