楊永晶，韓麗娟，孟 晶，索有瑞，常 珊，楊永棟

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001;2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生院，北京 100049;3 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810001;4 青?，幊厣锟萍加邢薰荆| 810599;5 青海省康樂(lè)醫(yī)院，西寧 810000

I 型糖尿病又稱(chēng)胰島素依賴(lài)型糖尿病，是一種由于機(jī)體產(chǎn)生異常自身免疫應(yīng)答破壞胰島β 細(xì)胞，使胰島素分泌絕對(duì)減少所致的自身免疫代謝性疾病［1］。這種復(fù)雜的異常自身免疫應(yīng)答的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，但多種研究證實(shí)胰島β 細(xì)胞損傷與多種免疫細(xì)胞和炎癥因子有關(guān)，包括T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、干擾素-γ(IFN-γ)、白介素(IL)等［2］。此外，氧化應(yīng)激在糖尿病的產(chǎn)生和發(fā)展中也扮演著重要角色［3］。異常自身免疫應(yīng)答產(chǎn)生的自由基對(duì)胰島β細(xì)胞亦具有極大地破壞作用。

皮下注射胰島素一直是治療Ⅰ型糖尿病的最主要手段，這種方法雖然能控制臨床癥狀，卻不能緩解胰島β 細(xì)胞的損傷［4］。此外，臨床上也嘗試應(yīng)用廣譜免疫抑制劑如環(huán)孢霉素、咪唑硫嘌呤、強(qiáng)的松以及抗胸腺細(xì)胞的免疫球蛋白等來(lái)治療Ⅰ型糖尿病。但隨著治療時(shí)間的增長(zhǎng)，這種免疫治療會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制［5］，給病人帶來(lái)極大的痛苦。

樹(shù)莓(Rubus idaeusL.)為薔薇科懸鉤子屬植物，又名覆盆子、山莓、牛奶泡等。樹(shù)莓主要分布于北半球溫帶和寒帶。近年來(lái)，隨著廣泛的人工培育、引種和種植，目前已有幾百個(gè)樹(shù)莓品種。樹(shù)莓果實(shí)為多漿小聚合果，味甜微酸，營(yíng)養(yǎng)豐富，其中含有大量的維生素、礦質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、氨基酸等。此外，樹(shù)莓果實(shí)中還含有多糖、有機(jī)酸、黃酮、花青素、多酚、揮發(fā)油、鞣質(zhì)等多種生物活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，樹(shù)莓具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗癌、抗疲勞等多種活性［6，7］，具有極高醫(yī)療保健作用，被譽(yù)為“黃金水果”。本研究采用鏈脲霉素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的大鼠模型來(lái)研究樹(shù)莓果粉在Ⅰ型糖尿病中降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化的活性。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠60 只，雄性，體重170～190 g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院［動(dòng)物合格證號(hào)為:SYXK(甘)2011-0001］。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

樹(shù)莓冷凍果(品種:Heritage 哈瑞太茲)，購(gòu)自青?，幊厣锟萍加邢薰?。鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自北京中生瑞泰科技有限公司。格列本脲片(glibenclamide，山西云鵬制藥，批號(hào)為:A130801)購(gòu)自同仁堂大藥房。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒;免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgM，細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(INF-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)以及CD4、CD8 分子酶聯(lián)免疫測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。其他試劑購(gòu)自青海天順化學(xué)試劑公司，均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

血糖測(cè)試儀及血糖試紙(三諾，天士力大藥房)、渦旋混合儀(TD-RS-1，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9203A，上海一恒科技有限公司)、高速連續(xù)型超微粉碎機(jī)(CLF-30B，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠(chǎng))、恒溫水浴鍋(DZKW-D-4，河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)、酶標(biāo)儀(RT-6000，北京裕天醫(yī)療技術(shù))、組織勻漿儀(FSH-2A，金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樹(shù)莓果粉及果粉混懸液的制備

將樹(shù)莓冷凍果置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中除去水分(溫度55 ℃)。用超微粉碎機(jī)粉碎樹(shù)莓干果(轉(zhuǎn)速22000 rpm，時(shí)間1～2 s)后過(guò)80 目篩網(wǎng)(孔徑0.2 mm)，除去完好無(wú)損的樹(shù)莓籽，即得到樹(shù)莓果粉。灌胃給藥前，稱(chēng)取一定量的樹(shù)莓果粉置于純水中，于渦旋混合儀上混合數(shù)次制成均勻的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 大鼠糖尿病模型的制備及給藥方法

SD 大鼠先進(jìn)行一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件如下:室溫22 ±2 ℃，相對(duì)濕度45 ±5%，使其自由飲水和進(jìn)食。造模前，大鼠尾靜脈采血，測(cè)血糖，稱(chēng)體重。之后禁食12 h，在大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下按60 mg/kg的濃度一次性腹腔注射STZ(將STZ 溶于pH4.2 的0.1 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液。為防止STZ 降解，必須在避光條件下配置和注射)。96 h 后尾靜脈采血測(cè)血糖，血糖值≥16.8 mmol/L 的大鼠即被認(rèn)定為糖尿病大鼠。將糖尿病大鼠隨機(jī)分為4 組，每組10 只，分別為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、樹(shù)莓果粉低劑量組和樹(shù)莓果粉高劑量組。另取10 只同批健康大鼠作為正常組。大鼠分組當(dāng)天稱(chēng)體重并給藥，給藥方式及劑量如下:正常組和模型組大鼠:純水;陽(yáng)性對(duì)照組:格列本脲片20 mg/kg;樹(shù)莓果粉低劑量組:樹(shù)莓果粉混懸液750 mg/kg;樹(shù)莓果粉高劑量組:樹(shù)莓果粉混懸液1500 mg/kg。給藥方式均為灌胃，連續(xù)給藥20 d，每5 d 測(cè)量血糖并稱(chēng)體重。

2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第21 d，大鼠腹腔注射水合氯醛溶液全身麻醉，經(jīng)頸總動(dòng)脈插管收集血液，并于3000 rpm 4℃離心10 min 獲取血清樣本。將血清樣本按50 μL分裝后于-80 ℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩⑹占^(guò)血液的大鼠脫頸椎處死，收集胰腺組織樣本。將一部分胰腺組織樣本浸泡于10%甲醛溶液中固定，用于組織病理學(xué)研究，另一部分樣本于-80 ℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

將胰腺組織稱(chēng)重，在冰浴條件下用事先預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L 蔗糖，0.8%氯化鈉溶液)制成10%勻漿液。3000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清。依照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中MDA、SOD、GSH 的含量。

血清中MDA、SOD、GSH 以及血清中免疫指標(biāo)IgG、IgA、IgE、IgM、IL-2、INF-γ、TNF-α、CD4、CD8 的測(cè)定均依照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4 組織病理學(xué)研究

將固定好的組織經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片貼片，二甲苯脫蠟，HE 染色，脫水透明，封固后于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 所致糖尿病大鼠基本體征的影響

造模后各組糖尿病大鼠的體重較正常大鼠均明顯下降，墊料較正常大鼠的潮濕，符合糖尿病的基本體征，這也從另一方面說(shuō)明此糖尿病模型是成功的。正常大鼠毛色有光澤，墊料干燥，體重穩(wěn)步增長(zhǎng)。模型組大鼠毛色枯槁，輕度脫毛，墊料潮濕，體重下降明顯。各給藥組大鼠毛色較模型組好，墊料潮濕情況較模型組有所減輕。體重下降情況較模型組明顯緩解，其中陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的體重與模型組相比有顯著性差異(*P＜0.05vs模型組)，樹(shù)莓果粉高低劑量組大鼠的體重與模型組相比有極顯著性差異(＊＊P＜0.01vs模型組)。此結(jié)果說(shuō)明樹(shù)莓果粉能明顯緩解糖尿病所致的體重下降(如圖1)。

圖1 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠體重的影響Fig.1 Effect of RPP on the body weight of STZ-induced diabetic rats

3.2 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 所致糖尿病大鼠血糖的影響

造模后，正常大鼠的血糖無(wú)明顯變化，而各組糖尿病大鼠血糖與正常大鼠相比均明顯升高。但隨著治療的進(jìn)行，情況出現(xiàn)明顯扭轉(zhuǎn)。給藥最后一天，各給藥組大鼠的血糖與模型組相比均有極顯著的下降(＊＊P＜0.01vs模型組)，且樹(shù)莓果粉的降血糖作用隨劑量的增加而增強(qiáng)，其中樹(shù)莓果粉高劑量組給藥最后一天的效果與陽(yáng)性藥格列本脲片相當(dāng)(見(jiàn)圖2)。

圖2 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響Fig.2 Effect of RPP on the blood glucose of STZ-induced diabetic rats

3.3 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 致糖尿病大鼠胰腺的影響

通過(guò)胰腺的組織病理切片可以看出，正常大鼠胰腺組織中的胰島形態(tài)規(guī)則，且均勻分布著大量胰島β 細(xì)胞。相比之下，模型組大鼠胰腺組織中的胰島由于受到STZ 的破壞而嚴(yán)重?fù)p傷，形態(tài)扭曲，胰島β 細(xì)胞數(shù)量銳減，且出現(xiàn)凋亡或壞死。給藥后，陽(yáng)性對(duì)照組以及樹(shù)莓果粉組大鼠的胰島與模型組相比均有明顯的恢復(fù)，主要表現(xiàn)為胰島細(xì)胞形態(tài)的規(guī)則化和胰島β 細(xì)胞數(shù)量的增加。說(shuō)明樹(shù)莓果粉能一定程度地修復(fù)STZ 對(duì)胰島造成的損傷(如圖3)。

圖3 糖尿病大鼠的胰腺組織病理學(xué)分析(400 ×)Fig.3 Histopathologic examination of pancreas in STZ-induced diabetic rats (H＆E stain，400 ×)

3.4 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠的免疫調(diào)節(jié)

3.4.1 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 所致的糖尿病大鼠血清中CD4、CD8 分子的影響

如圖4 所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中CD4 和CD8 分子的濃度極顯著升高(##P＜0.01vs常組)。在樹(shù)莓果粉的作用下，糖尿病大鼠血清中CD4 分子的濃度較模型組顯著性下降(*P＜0.05vs模型組)，CD8 分子的濃度與模型組相比極顯著性地下降(＊＊P＜0.01vs模型組)。而陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中CD4 和CD8 分子的濃度較模型組無(wú)明顯改變。

圖4 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠血清中CD4、CD8 分子的影響Fig.4 Effects of RPP on the levels of CD4 and CD8 in serum of STZ-induced diabetic rats

3.4.2 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 所致的糖尿病大鼠血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ 的影響

如圖5 所示，模型組大鼠血清中IL-2、TNF-α 和IFN-γ 的含量較正常大鼠急劇增加(##P＜0.01vs正常組)，而樹(shù)莓果粉則明顯減弱了這一趨勢(shì)。樹(shù)莓果粉高、低劑量組大鼠血清中的IL-2、TNF-α 和IFNγ 較模型組均顯著下降(*P＜0.05，＊＊P＜0.01vs模型組)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中IL-2、TNF-α 和IFN-γ 的含量與模型組相比無(wú)明顯改變。

圖5 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠血清中TNF-α、IFN-γ 和IL-2 的影響Fig.5 Effects of RPP on the concentrations of TNF-α，IFNγ and IL-2 in serum of STZ-induced diabetic rats

3.4.3 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 所致的糖尿病大鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgM 的影響

圖6 為各組大鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgA、IgE 和IgM 的含量，可以看出模型組大鼠血清中4種免疫球蛋白與正常大鼠相比具有極顯著的增加(##P＜0.01vs正常組)。樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠血清中IgM 無(wú)明顯影響，與模型組相比無(wú)顯著性差異。但樹(shù)莓果粉能顯著降低糖尿病大鼠血清中IgG、IgA和IgE 的濃度(*P＜0.05，＊＊P＜0.01vs模型組)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中IgG、IgA、IgE 和IgM 的含量與模型組相比均無(wú)明顯改變。

圖6 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠血清中IgG、IgA、IgE 和IgM 含量的影響Fig.6 Effects of RPP on the concentrations of IgG，IgA，IgE and IgM in serum of STZ-induced diabetic rats

3.5 樹(shù)莓果粉對(duì)STZ 所致糖尿病大鼠血清、胰腺中SOD、GSH 和MDA 的影響

如圖7 所示，模型組大鼠胰腺和血清中的SOD活性和GSH 含量與正常組相比明顯下降，而MDA的含量較正常組顯著上升(##P＜0.01vs正常組)。格列本脲與樹(shù)莓果粉均能明顯增加糖尿病大鼠胰腺和血清中的SOD 的活性和GSH 含量，并降低MDA的含量(*P＜0.05，＊＊P＜0.01vs模型組)。樹(shù)莓果粉的作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

圖7 樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠胰腺和血清中SOD、GSH 和MDA 的影響Fig.7 Effects of RPP on SOD，GSH and MDA in pancreas and serum of STZ-induced diabetic rats

4 討論

STZ 是一種天然化學(xué)物質(zhì)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型的建立中。STZ 能特異性地?fù)p傷分泌胰島素的胰島β 細(xì)胞，并引起導(dǎo)致Ⅰ型糖尿病的自身免疫反應(yīng)，且模型的臨床表現(xiàn)與組織病理同人類(lèi)的Ⅰ型糖尿病極為相似［8，9］。此外，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型還具有氧化應(yīng)激的特點(diǎn)，這正是其他糖尿病模型所缺乏的［10］。因此，本研究采用STZ 誘導(dǎo)的大鼠模型來(lái)研究樹(shù)莓果粉在Ⅰ型糖尿病中降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化的活性。

Ⅰ型糖尿病的臨床表現(xiàn)為典型的“三多一少”癥狀，即多飲、多食、多尿和體重下降，并伴有血糖及尿糖的升高。在本研究中，樹(shù)莓果粉能增加糖尿病大鼠的體重，降低其血糖，并對(duì)糖尿病大鼠受損的胰島有一定的修復(fù)作用，顯示出了較好的治療Ⅰ型糖尿病的活性。

胰島β 細(xì)胞的損傷是由機(jī)體異常的自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的。這種復(fù)雜的自身免疫過(guò)程是由多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子協(xié)同作用完成的，其過(guò)程大致如下:負(fù)責(zé)β 細(xì)胞抗原遞呈的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞激活CD4+T 淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞釋放的IL-12 能刺激CD4+T 淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 和IL-2。IFN-γ 進(jìn)一步激活其余巨噬細(xì)胞并使其依次釋放IL-1β、TNF-α 以及自由基等，這些對(duì)β 細(xì)胞都會(huì)造成極大的損傷。此外，CD4+T 淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能協(xié)助CD8+T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞相互作用。最終，CD8+T 淋巴細(xì)胞直接攻擊攜帶目標(biāo)抗原的β 細(xì)胞，造成β 細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷甚至裂解［11，12］。外周血中的CD4 和CD8 分子是CD4+與CD8+的可溶形式，它們被認(rèn)為是T 淋巴細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)莓果粉能明顯降低糖尿病大鼠血清中CD4 和CD8 分子的含量，說(shuō)明樹(shù)莓果粉能減緩T 淋巴細(xì)胞的激活。此外，樹(shù)莓果粉還能降低糖尿病大鼠血清中IFN-γ、IL-2 以及TNF-α的濃度。雖然B 淋巴細(xì)胞及其所產(chǎn)生的多種免疫球蛋白在Ⅰ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中作用尚不明確，但本研究發(fā)現(xiàn)樹(shù)莓果粉對(duì)糖尿病大鼠血清中的IgG、IgA 和IgE 存在一定的影響。以上結(jié)果說(shuō)明，樹(shù)莓果粉能減緩Ⅰ型糖尿病大鼠自身免疫反應(yīng)的程度，從而減少了胰島β 細(xì)胞的損傷。而本研究中的陽(yáng)性藥對(duì)以上免疫指標(biāo)未產(chǎn)生明顯影響。原因是格列本脲片是通過(guò)刺激胰腺胰島細(xì)胞分泌胰島素，抑制肝糖原分解和糖原異生作用以及增加胰外組織對(duì)胰島素的敏感性來(lái)達(dá)到降血糖作用的，其并沒(méi)有免疫調(diào)節(jié)的活性。

氧化應(yīng)激也是胰島β 細(xì)胞受損的重要因素之一。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，它的不斷積累會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并引起細(xì)胞的代謝障礙產(chǎn)生細(xì)胞毒作用［14］。MDA 含量能間接反映細(xì)胞的損傷程度。SOD 是清除氧自由基的主要酶，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的傷害。GSH 是由蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種自由基清除劑。SOD 和GHS 在機(jī)體的自由基平衡中均具有重要作用，它們的含量能間接反映機(jī)體抗氧化損傷和清除氧自由基的能力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)莓果粉能顯著增強(qiáng)糖尿病大鼠胰腺和血清中的SOD 活性，增加GSH 含量，并明顯降低MDA 的含量，說(shuō)明樹(shù)莓果粉能很好地改善胰島β 細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀況，從而緩解β 細(xì)胞的損傷。

綜上所述，樹(shù)莓果粉顯示出了良好的治療Ⅰ型糖尿病的活性，且其能通過(guò)減緩Ⅰ型糖尿病大鼠自身免疫反應(yīng)的程度和改善氧化應(yīng)激狀況來(lái)緩解胰島β 細(xì)胞的損傷。此研究為樹(shù)莓的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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