滿淑麗，劉延濤，張 咪，郭松波，高文遠(yuǎn)

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的化學(xué)成分復(fù)雜、藥理作用顯著，臨床常協(xié)同其他藥物使用.作為藥用植物，甘草具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌、抗炎、抗過敏、抗?jié)?、抗衰老等多種生物活性作用[1].隨著甘草使用量的不斷加大、資源隨之減少，組培甘草將成為可以解決供應(yīng)緊張的栽培甘草的替代品.組培甘草的培養(yǎng)周期要短于栽培甘草，并且能產(chǎn)生大量的多糖、黃酮、三萜等有效成分.課題組前期已成功獲得組培甘草[2]，本文旨在研究比較栽培甘草與組培甘草之間提取物含量及抗氧化活性差異，最終探討組培甘草輔助或替代栽培甘草的效果及可行性.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

栽培甘草購自天津同仁堂藥店，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞甘草種子由北京時(shí)珍中草藥研究所提供，經(jīng)天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院高文遠(yuǎn)教授鑒定為烏拉爾甘草(G.uralensis Fisch)的種子.甘草懸浮細(xì)胞采用兩步培養(yǎng)方式培養(yǎng)，具體方法參考文獻(xiàn)[2].

1.2 試劑與儀器

香草醛，天津市元立化工有限公司；蒽酮(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠；吐溫40、亞油酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯(DPPH)，Sigma 公司；其余試劑均為分析純.

LAEOROTA 4000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵，鞏義市于華儀器有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀，基因有限公司；TU-1810 型紫外-可見光分光光度計(jì)，北京市普斯通科技有限責(zé)任公司；TD6M 型臺(tái)式低速離心機(jī)，鹽城市凱特儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘草水提物(甘草多糖)

取經(jīng)粗研磨的組培甘草和栽培甘草粉末制成甘草提取液，4,000,r/min 離心 12,min，取上清液于70,℃、60,r/min 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮.收集所得栽培甘草濃縮液.在4 倍體積的無水乙醇中加入栽培甘草濃縮液，靜置出現(xiàn)絮狀沉淀.經(jīng)離心處理收集沉淀，干燥后得到甘草粗多糖.

Sevag 法脫蛋白：加入1/4 體積的氯仿-正丁醇(4∶1)溶液劇烈振蕩15,min，靜止分層后棄有機(jī)層，離心除水去掉水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)操作5 次，合并上清液，測(cè)量其蛋白質(zhì)含量和多糖含量.將所得脫蛋白多糖再次醇沉，干燥后得到精制的栽培甘草多糖和組培甘草多糖.

1.3.2 甘草醇提物(黃酮類)

稱取栽培甘草和組培甘草樣品各100,g，用80%,乙醇進(jìn)行提取，料液比(g∶mL)為1∶20，靜置1,h后，超聲處理30,min，68,℃水浴2,h，冷卻后過濾，對(duì)提取過的濾渣用0.5%,的氨性乙醇提取(乙醇60%,)，料液比(g∶mL)為1∶20，靜置12,h 后，68,℃水浴1,h 抽濾，合并3 次提取的濾液，濃縮干燥后得到的甘草浸膏即為實(shí)驗(yàn)所需甘草醇提物.

1.3.3 甘草中各有效部位的含量分析

甘草多糖含量的測(cè)定：分別稱取干燥的栽培甘草多糖和組培甘草多糖樣品.參考孟娟[3]的方法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸蒽酮法測(cè)定多糖含量，做3組平行實(shí)驗(yàn).

皂苷含量的測(cè)定：參考蘭霞等[4]的方法.分別取栽培甘草和組培甘草醇提物各20,mg，加甲醇溶解并定容至10,mL，取組培甘草樣品溶液2,mL、栽培甘草樣品溶液500,μL 水浴揮干，以香草醛-冰醋酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-高氯酸比色法測(cè)定皂苷含量，測(cè)定吸光度，做3 組平行實(shí)驗(yàn).

總黃酮含量的測(cè)定：分別取栽培甘草和組培甘草醇提物各25,mg，加蒸餾水溶解并定容至25,mL，取栽培甘草和組培甘草樣品溶液各1,mL，置于10,mL容量瓶中，參考前期報(bào)道[5]方法，測(cè)定吸光度，做3 組平行實(shí)驗(yàn).

1.3.4 甘草的抗氧化活性研究實(shí)驗(yàn)

普魯士蘭法：參考李東海等[6]的方法.分別將栽培甘草和組培甘草的樣品配制成15,mg/mL 的待測(cè)樣品溶液，按測(cè)定抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟，在700,nm 處測(cè)其吸光度，做3 組平行實(shí)驗(yàn).

水楊酸比色法：將栽培甘草和組培甘草各配制出0.5、1、2、4、6,mg/mL這5個(gè)梯度的樣品溶液.參考袁建梅等[7]的方法，并做適當(dāng)調(diào)整，做3 組平行實(shí)驗(yàn).

DPPH 清除自由基法：參考張丹參等[8]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整選取合適的樣品濃度.分別吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0,mL 于試管中，并用無水乙醇定容至2,mL.加入1.0,mL DPPH 試劑后，37,℃反應(yīng)30,min，于517,nm 處測(cè)定吸光度.

β-胡蘿卜素褪黑法：參考黃海蘭等[9]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整.取樣品溶液0.5,mL，加入5,mL 的β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液，以蒸餾水為空白對(duì)照組.樣品加入后開始于470,nm 處測(cè)量吸光度，此時(shí)記為0,min，之后每20,min 測(cè)1 次至120,min 結(jié)束.期間將反應(yīng)試管置于50,℃水浴中保溫.

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0軟件處理，采用 t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與討論

2.1 甘草活性成分的含量分析

2.1.1 甘草多糖

本實(shí)驗(yàn)采用栽培甘草和組培甘草粉末分別為150,g 和100,g.經(jīng)粗提取和精制后多糖質(zhì)量分別為2.04,g 和5.20,g.

依據(jù)硫酸-蒽酮比色法，在585,nm 處測(cè)量進(jìn)行比色，得到樣品的吸光度.結(jié)果顯示，組培甘草中分離得到的精制甘草多糖高于栽培甘草，存在顯著性差異(P＜0.05)，它們分別為(21.6±0.1)%,和(19.2±0.2)%,.

2.1.2 甘草皂苷和黃酮含量測(cè)定

植物組織培養(yǎng)基技術(shù)作為一種高效的生物技術(shù)已經(jīng)在生產(chǎn)很多植物次生代謝產(chǎn)物得到了應(yīng)用[10].通過測(cè)定，組培甘草的總皂苷含量為(7.0±0.2)%,，栽培甘草的總皂苷含量為(45.4±1.1)%,；通過紫外-可見光分光光度計(jì)，在400,nm 下測(cè)得組培甘草的總黃酮含量為(31.2±1.5)%,，栽培甘草的總黃酮含量為(30.6±1.9)%.

2.2 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 普魯士蘭法

根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性回歸方程為y＝0.003,0,x+0.161,3，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999,2，該方法呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，測(cè)定結(jié)果見表1.

表1 栽培甘草和組培甘草中各成分抗氧化活性比較Tab.1 Comparison of the antioxidization activity of each component

由表1 可知，栽培甘草醇提物與組培甘草醇提物當(dāng)中的還原物質(zhì)含量相當(dāng)，不存在顯著性差異.而精制多糖中，組培甘草顯著高于栽培品種.

2.2.2 水楊酸比色法

通過實(shí)驗(yàn)對(duì)4 種樣品的氧自由基清除能力進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1 所示.在實(shí)驗(yàn)研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，4 種樣品對(duì)氧自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而上升，且在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，組培甘草醇提物抗氧化能力最強(qiáng)，其次為栽培甘草醇提物，再次為組培甘草多糖，抗氧化能力最弱的為栽培甘草多糖.

圖1 4種樣品對(duì)羥基自由基清除率曲線Fig.1 Curves of hydroxyl radical scavenging rate

2.2.3 DPPH 清除自由基法

由圖2 可知，4 種樣品對(duì)DPPH 自由基均有明顯清除效果，在較低濃度時(shí)，4 種樣品對(duì)DPPH 的清除率呈現(xiàn)近似線性關(guān)系，栽培甘草多糖與組培甘草黃酮此時(shí)清除率較為近似、栽培甘草黃酮與組培甘草黃酮之間的清除率較為近似，甘草中多糖與黃酮的清除率差距較大.

圖2 4種樣品對(duì)DPPH的清除率曲線Fig.2 Curves of DPPH scavenging rate

為準(zhǔn)確量化對(duì)4 種樣品清除DPPH 能力的大小，應(yīng)用SPSS 軟件計(jì)算清除率達(dá)到50%,的時(shí)候的IC50值(見表1).IC50值越小，則證明該樣品對(duì)DPPH清除能力越強(qiáng)，抗氧化能力也越強(qiáng).

綜上，清除DPPH 的能力為：組培甘草黃酮＞栽培甘草黃酮＞組培甘草多糖＞栽培甘草多糖.

2.2.4 β-胡蘿卜素褪黑素法

圖3 為2,mg/mL 樣品組所測(cè)得的抗氧化活性結(jié)果.結(jié)果顯示抗氧化活性最高的為栽培甘草多糖，其次為栽培甘草黃酮，再次為組培甘草多糖，最弱的是組培甘草黃酮.

為量化比較樣品的抗氧化能力，分別計(jì)算出兩個(gè)樣品組清除率達(dá)到50%,所需時(shí)間.2 mg/mL 樣品組結(jié)果見表1.

圖3 β-胡蘿卜素褪黑素法抑制曲線Fig.3 Curves of β-carotene melatonin suppression

根據(jù)表1 可以看出，總還原力比較中，組培甘草黃酮與栽培甘草黃酮活性相當(dāng)，組培甘草多糖顯著高于栽培甘草多糖.水楊酸及DPPH 實(shí)驗(yàn)均基于自由基清除原理，通過活性分析發(fā)現(xiàn)抗氧化效果較好的是組培甘草黃酮和組培甘草多糖；β-胡蘿卜素-亞油酸模型表明栽培甘草多糖與組培甘草多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化活性.由于以上模型的抗氧化機(jī)制不同，因此，組培甘草可能主要通過自由基清除和總還原性物質(zhì)含量較高等發(fā)揮抗氧化活性.

3 結(jié)論

組培甘草多糖含量顯著高于栽培甘草多糖，而組培甘草皂苷類含量顯著性低于栽培甘草；黃酮類成分兩者含量相當(dāng)，不存在顯著性差異.因此在開發(fā)其活性時(shí)更側(cè)重于對(duì)甘草多糖及黃酮類活性的研究.通過抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，組培甘草和栽培甘草黃酮活性相當(dāng)，組培甘草多糖顯著強(qiáng)于栽培甘草多糖.水楊酸及DPPH 實(shí)驗(yàn)均基于自由基清除原理，通過活性分析發(fā)現(xiàn)抗氧化效果較好的是組培甘草黃酮和多糖；β-胡蘿卜素亞油酸模型表明栽培甘草和組培甘草多糖均具有較強(qiáng)抗氧化活性.由于以上模型的抗氧化機(jī)制不同，因此，組培甘草可能主要通過自由基清除和總還原性物質(zhì)含量較高等發(fā)揮抗氧化活性.總之，組培甘草的各個(gè)有效部位均顯示較好的抗氧化活性，因此，研究發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞技術(shù)將作為一個(gè)新的途徑使輔助或替代栽培甘草成為一種可能.

［1］Asl M N，Hosseinzadeh H.Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp.and its bioactive compounds[J].Phytotherapy Research，2008，22(6)：709-724.

［2］Guo Songbo，Man Shuli，Gao Wenyuan，et al.Production of flavonoids and polysaccharide by adding elicitor in different cellular cultivation processes of Glycyrrhiza uralensis Fisch[J].Acta Physiologiae Plantarum，2013，35(3)：679-686.

［3］孟娟.蒽酮-硫酸比色法測(cè)定甘草殘?jiān)卸嗵呛縖J].天津化工，2011，25(5)：45-46.

［4］蘭霞，王洪新.比色法測(cè)定甘草中總皂苷的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)醫(yī)藥，2007，18(4)：886-887.

［5］Man Shuli，Wang Juan，Gao Wenyuan，et al.Chemical analysis and anti-inflammatory comparison of the cell culture of Glycyrrhiza with its field cultivated variety[J].Food Chemistry，2013，136(2)：513-517.

［6］李東海，楊發(fā)忠，代紅娟，等.葉下花黃酮抗氧化活性研究[J].云南化工，2009，36(2)：32-35.

［7］袁建梅，尚學(xué)芳，汪應(yīng)靈，等.谷精草總黃酮提取及對(duì)羥自由基清除作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(4)：894-895.

［8］張丹參，張?zhí)焯?，杜冠華.均勻設(shè)計(jì)高通量篩選技術(shù)在中藥丹參多成分配比研究中的應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44(14)：1048-1052.

［9］黃海蘭，趙祖亮，王斌貴.磷鉬絡(luò)合物法與β-胡蘿卜素-亞油酸法測(cè)定海藻脂類成分抗氧化活性的比較[J].中國石油，2005，30(3)：32-35.

［10］Wang Juan，Man Shuli，Gao Wenyuan，et al.Cluster analysis of Ginseng tissue cultures，dynamic change of growth，total saponins，specific oxygen uptake rate in bioreactor and immunoregulative effect of ginseng adventitious root [J].Industrial Crops and Products，2013，41：57-63.