陳博宇,王超英,陳維毅,劉迎慶,郝 嵐

·實驗論著·

豚鼠早期實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞bFGF表達變化的研究

陳博宇1,王超英1,陳維毅2,劉迎慶1,郝 嵐1

目的:研究豚鼠早期實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞前部及后極部堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的改變,探索近視的發(fā)病機制。

豚鼠;視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞;堿性成纖維細(xì)胞生長因子;免疫細(xì)胞化學(xué);實時熒光定量PCR;Western-blot蛋白印跡法

引用:陳博宇,王超英,陳維毅,等.豚鼠早期實驗性近視眼視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞bFGF表達變化的研究.國際眼科雜志2015; 15(11):1857-1861

0 引言

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纖維細(xì)胞生長因子家族的一個重要成員,能促進多種來自中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞生長、增殖和分化,還參與細(xì)胞外基質(zhì)的形成。目前認(rèn)為視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞具有合成bFGF的能力,但正常情況下不分泌,可能只在病理環(huán)境如細(xì)胞損害或在細(xì)胞培養(yǎng)的高轉(zhuǎn)化條件下,RPE細(xì)胞中的bFGF基因才表達[1-3]。在近視發(fā)生過程中,RPE上的bFGF通過受體機制逐級將信息傳遞到鞏膜組織,進而通過影響鞏膜細(xì)胞的增殖和(或)細(xì)胞外基質(zhì)的合成或降解,使鞏膜重新塑形,眼軸過度延長,形成近視。目前人們對豚鼠透鏡誘導(dǎo)近視眼RPE細(xì)胞中bFGF的表達變化的研究罕有報道,而不同部位RPE細(xì)胞分泌因子的差異更無人報道。為此,本研究在成功建立透鏡誘導(dǎo)近視眼模型的基礎(chǔ)上,定位到前部及后極部RPE細(xì)胞,分析不同部位的bFGF在近視發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用,為進一步在細(xì)胞因子水平對病理性近視眼發(fā)生機制的研究提供補充和相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物隨機選取兩周齡已脫離母乳喂養(yǎng)的小豚鼠30只60眼,分為A組、B組、C組,每組各10只,再隨機選取5只10眼正常兩周齡豚鼠不作任何干預(yù),作為正常對照眼(Norma-contro,NC組),雌雄不限,由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物養(yǎng)殖場提供。制備A組、B組、C組的鏡片誘導(dǎo)型近視(lens-induced myopia,LIM)動物模型,誘導(dǎo)眼為實驗組(LIM組),對側(cè)眼為自身對照組(SC組)。實驗眼是采用離焦點的方法用-10.00D[4]凹透鏡誘導(dǎo)成近視眼模型。遮蓋時間分別為6d(A組)、15d(B組)、30d (C組)。幼豚鼠于室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化喂養(yǎng),白天用自然光照射,每日光照與黑暗的周期比例為14∶10,室溫控制在20℃。

1.1.2 凹透鏡片自行設(shè)計的PMMA鏡片,部分參數(shù)如下:鏡片直徑11.0mm,光學(xué)直徑9.5mm,基弧為9.0,屈光度均為-10.00D,上海菲士康視光有限公司。

1.1.3 試劑F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibico公司);胎牛血清、小牛血清(杭州四季青公司);培養(yǎng)瓶、六孔板(美國Corning公司)。兔抗鼠Vimentin、Desmin、keratin、S-100I抗體及免疫組織化學(xué)的劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF,北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Trizol(Invitrogen公司, USA);RNase Inhibitor(Promega公司,USA);M-MLV RT酶(Promega公司,USA);DNTP(Promega公司,USA);Taq酶(5U/μL,Sigma公司,USA)。

1.2 方法

1.2.1 RPE細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定將豚鼠標(biāo)記編號,驗光及測眼軸長度。將三組豚鼠分別喂養(yǎng)6、15、30d后,摘除鏡片,按前述方法驗光及測眼軸長度。顯微鏡下沿角膜緣后2mm環(huán)形剪開眼球壁,去除角膜、晶狀體、玻璃體,以撕囊鑷夾住視盤部位視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮,剪開一小口,由此切口輕緩揭去視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮,再沿赤道部環(huán)形剪開,分成前部和后極部兩部分。采用細(xì)胞酶消化法培養(yǎng)豚鼠的RPE細(xì)胞。用免疫細(xì)胞化學(xué)法對培養(yǎng)的細(xì)胞進行鑒定。步驟為:將融合的原代細(xì)胞用2.5g/L胰酶消化,吹打,離心,去上清液,加F-12培養(yǎng)液,將其制備成1× 106個/mL細(xì)胞懸液,吸取2mL,加入有蓋玻片的24孔板內(nèi),細(xì)胞貼壁并開始生長后取出蓋玻片,PBS沖洗3遍, 4%多聚甲醛固定15min。將生長有RPE細(xì)胞的蓋玻片浸入4%多聚甲醛固定15min,PBS沖洗3次,各2min。然后滴加1%Triton X-100(DPBS配),室溫孵育20min。PBS清洗3次,各2min。3%H2O2孵育15min,然后PBS清洗標(biāo)本3次,各2min。封閉液孵育20min。以PBS 1∶50稀釋一抗Vimentin,Desmin,Keratin,S-100),4℃于濕盒中孵育過夜,PBS清洗3次,各5min。以PBS代替一抗,作陰性對照。二抗工作液37℃孵育30min,PBS清洗3次,各5min。C液(鏈親和霉素-過氧化物酶溶液)于37℃孵育30min,PBS清洗3次,各5min。DAB顯色約3min,蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染0.5～1min,自來清洗,酒精梯度脫水,中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性空白對照:以PBS代替一抗,作陰性對照。由經(jīng)驗豐富的病理科技師采用雙盲法獨立觀察,每張細(xì)胞爬片觀察高倍鏡(LM×400)下3個視野,陽性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒,分布于細(xì)胞漿中。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF的表達將有RPE細(xì)胞的蓋玻片放入濕盒內(nèi),每張玻片加50μL Triton室溫下通透15min,PBS沖洗3×5min。鏈親和霉素-過氧化物酶溶液浸泡6min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗3×5min。高壓鍋加熱抗原修復(fù)液處理2min,室溫冷卻20min,PBS沖洗3×5min。以PBS 1:50稀釋50μL一抗(兔抗bFGF多克隆抗體,1∶100),37℃孵育60min,PBS沖洗3×5min。滴加生物素標(biāo)記的50μL二抗,室溫40min,PBS沖洗3×5min。DAB顯色,取1mL蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻后加至玻片上,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,一般在5～10min之間(胞漿呈棕黃色為陽性),蒸餾水充分洗滌終止顯色時間。自來水充分沖洗,蘇木素復(fù)染10min,梯度脫水,中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。陰性空白對照:以PBS代替一抗,作陰性對照。結(jié)果判定:由經(jīng)驗豐富的病理科技師采用雙盲法獨立觀察,每張細(xì)胞爬片觀察高倍鏡(LM×400)下3個視野,陽性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒。陰性(-):無表達;(+):著色淺,成淡黃色,高倍鏡下明確陽性;(++):著色中等,棕黃色,低倍鏡下明確陽性;(+++):大量,棕色,著色深;(++++):密集片狀,深棕色,著色強烈。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF m RNA表達

圖1 豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定結(jié)果(×400) A:keratin(+);B:S-100(±);C:Vimentin(-);D:Desmin(-)。

1.2.3.1 目的基因引物的合成引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:GAPDH:上游引物:5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3',下游引物:5'-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3';BFGF(187bp):上游引物5'-GAGTTGTGTCTATCAAGGGAGTC-3',下游引物5'-TGTCCAGTTCGTTTCAGTGC-3'。

1.2.3.2 提取RNA的完整性檢測及提取RNA的定量

標(biāo)本及組織總RNA留取后,取RNA溶液4μL,經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,明顯可見28S、18S條帶,且28S為18S條帶的兩倍,5S條帶較弱,且彌散,表明RNA降解較少,完整性良好。用756型紫外分光光度計分別測定OD260與OD280,OD260/OD280比值在1.8～2.0之間,表明提取的RNA蛋白污染很少,因此可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用756型紫外分光光度計測量OD260/OD280比值,可檢測RNA的純度和含量,選用OD260/OD280比值為1.8～2.0的RNA用作反轉(zhuǎn)錄。RNA含量采用紫外分光光度計檢測法。

1.2.3.3 Syber Green熒光定量PCR檢測PCR熱循環(huán)參數(shù):96℃4min,然后三步反應(yīng):94℃30S,58℃30s,72℃30s,進行40個循環(huán),于每個循環(huán)的第三步72℃30s收集熒光信號。選擇數(shù)據(jù)分析方式,用實時熒光定量PCR結(jié)果分析。本實驗采用相對定量法中的CT值比較法檢驗基因的表達變化。擴增完畢后,進入結(jié)果分析界面,以GAPDH為內(nèi)參照基因,與對照組相比,得到目的基因表達的相對定量值(RQ值),我們將RQ值用于統(tǒng)計分析。

1.2.4 Western-blot印跡法定量檢測豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF蛋白表達

1.2.4.1 蛋白質(zhì)抽提及定量收集各組細(xì)胞,用冷PBS洗滌3次后,將細(xì)胞重懸于細(xì)胞裂解液中,冰浴6min,使細(xì)胞充分裂解。離心,收集上清,分裝凍存。配置BCA工作液(WR);分別吸25μL標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品至微孔板對應(yīng)孔中,每孔加入200μL的BCA工作液(WR),震板6s以徹底混合均勻,蓋好微孔板,37℃孵育6min,冷卻至室溫;測量各孔590nm的吸光度值;測得的每個標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔的吸光度值分別減去空白孔平均吸光度值;以校正過的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白測量值對其濃度(μg/mL)做圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測樣品蛋白濃度。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)PVDF膜SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后對凝膠進行半干轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜緩沖液為48mmol/L Tris, 39mmol/L甘氨酸,1.3mmol/L SDS,20%甲醇,pH=9.2)。半干式轉(zhuǎn)膜槽陰極在上,陽極在下。緩沖液為連續(xù)緩沖液,蛋白質(zhì)移動方向由上而下。轉(zhuǎn)移電流50～250mA,轉(zhuǎn)移時間20～60min。封閉:轉(zhuǎn)膜完畢,取出PVDF膜,置于含50g/L脫脂奶粉的TTBS(10mmol/L Tris-HCl,pH=8.0, 60mmol/L NaCl,0.05%Tween-20)封閉液中,于室溫封閉2h。一抗(兔抗bFGF多克隆抗體,1∶100)結(jié)合:將封閉后的PVDF膜置入TTBS適當(dāng)稀釋的一抗溶液中,4℃緩慢搖動過夜。洗膜:取出PVDF膜放入盛有適量TTBS的平皿中,室溫洗膜,每次10min,共3次。二抗結(jié)合:將PVDF膜置入適量以TTBS 1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中,于室溫反應(yīng)2h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測:用TTBS室溫洗膜3次,每次10min,然后用TBS(10mmol/L Tris-HCl,pH=8.0,60mmol/L NaCl)洗膜1次,約5min?？贵w結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測。信號強度用Bio 1D圖像分析軟件進行相對定量分析。

統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,凡對照組與實驗組間差異分別行配對樣本t檢驗,組間差異行完全隨機單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定結(jié)果細(xì)胞免疫化學(xué)法鑒定顯示:RPE細(xì)胞Keratin染色陽性,胞漿內(nèi)可見大量棕色陽性反應(yīng)產(chǎn)物,S-100染色弱陽性,胞漿內(nèi)多呈棕黃色,Vimentin染色陰性, Desmin染色陰性,證實所培養(yǎng)的細(xì)胞為RPE細(xì)胞(圖1)。

2.2 豚鼠RPE細(xì)胞中bFGF的陽性表達bFGF的表達定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。各誘導(dǎo)時間段前部及后極部RPE細(xì)胞均有bFGF的表達,LIM組前部及后極部與SC組相應(yīng)前部及后極部比較,LIM組中bFGF的陽性表達率低于SC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而且,隨著誘導(dǎo)時間的推移,LIM組的陽性表達率逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),SC組的陽性表達率不變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);但LIM組和SC組各組自身前部及后極部比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,圖2,表1)。

2.3 豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF m RNA表達

各誘導(dǎo)時間段前部及后極部RPE細(xì)胞均有bFGF mRNA的表達,LIM組前部及后極部與SC組相應(yīng)前部及后極部比較,LIM組中bFGF mRNA的表達量低于SC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而且,隨著誘導(dǎo)時間的推移,LIM組的表達量逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),SC組的表達量不變,差異LIM組和SC組各組自身前部及后極部比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,圖3,表2)。

2.4 豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF蛋白表達A、B、C三組實驗眼和對照眼前部及后極部RPE細(xì)胞均有bFGF的表達,LIM組前部及后極部與SC組相應(yīng)前部及后極部比較,LIM組中bFGF蛋白的表達量低于SC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而且,隨著誘導(dǎo)時間的推移, LIM組的表達量逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), SC組的表達量不變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);但LIM組和SC組自身前部及后極部比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,圖4,表3)。

圖2 豚鼠RPE細(xì)胞中bFGF的細(xì)胞免疫化學(xué)法陽性表達(×400) A:實驗組前部(30d);B:實驗組后極部(30d);C:實驗組前部(15d);D:實驗組后極部(15d);E:實驗組前部(6d);F:實驗組后極部(6d);G:對照組前部;H:對照組后極部。

表1 豚鼠RPE細(xì)胞中bFGF的細(xì)胞免疫化學(xué)法陽性表達

圖3 豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGFm RNA表達的對比 1:實驗組前部;2:實驗組后極部;3:對照組前部;4:對照組后極部。

圖4 豚鼠前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF蛋白表達 1:對照組前部;2:實驗組前部(6d);3:實驗組前部(15d);4:實驗組前部(30d);5:對照組后極部;6:實驗組后極部(6d);7:實驗組后極部(15d);8:實驗組后極部(30d)。

3 討論

堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)在體內(nèi)廣泛分布,它能夠參與細(xì)胞外基質(zhì)的形成,誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達,減少膠原的形成。以往研究表明,形覺剝奪性近視眼(form deprivation myopia,FDM)鞏膜后極部bFGF的表達明顯降低,而在視網(wǎng)膜色素上皮脈絡(luò)膜的表達與非FDM組類似[4]。bFGF對近視的眼軸延長提供了一個停止信號,對FDM眼行玻璃體或球結(jié)膜下注射bFGF均能抑制FDM的形成,而且與bFGF呈劑量相關(guān)性[5]。bFGF的免疫活性水平在FDM眼視網(wǎng)膜外層中升高。故推測形覺剝奪這種異常的視覺環(huán)境使視網(wǎng)膜細(xì)胞表達bFGF基因,產(chǎn)生bFGF后作用于剝奪眼而產(chǎn)生上述變化[6]。由此表明, bFGF也許代表作用RPE的視網(wǎng)膜信息以及其可能通過某些中介因子調(diào)控鞏膜MMP-2 mRNA表達,影響FDM形成。

表2 RPE細(xì)胞中不同時期bFGFm RNA表達的對比±s

表2 RPE細(xì)胞中不同時期bFGFm RNA表達的對比±s

注:aP＜0.05 vs對照組;bP＜0.05 vs誘導(dǎo)前;cP＞0.05 vs誘導(dǎo)前。

時間點組別眼數(shù)部位2-ΔΔCt誘導(dǎo)前正常組10前部2.535±0.625后極部2.490±0.389誘導(dǎo)6d后實驗組10前部1.134±0.661a,b后極部1.319±0.509a,b對照組10前部2.579±0.200c后極部2.323±0.338c誘導(dǎo)15d后實驗組10前部1.056±0.446a,b后極部1.081±0.362a,b對照組10前部2.616±0.574c后極部2.880±0.645c誘導(dǎo)30d后實驗組10前部0.691±0.147a,b后極部0.701±0.175a,b對照組10前部2.582±0.657c后極部2.614±0.336c

表3 RPE細(xì)胞中不同時期bFGF蛋白表達的對比±s

表3 RPE細(xì)胞中不同時期bFGF蛋白表達的對比±s

注:aP＜0.05 vs對照組;bP＜0.05 vs誘導(dǎo)前;cP＞0.05 vs誘導(dǎo)前。

時間點組別眼數(shù)部位bFGF/β-actin誘導(dǎo)前正常組10前部1.5135±0.010后極部1.5135±0.014誘導(dǎo)6d后實驗組10前部0.6544±0.015a,b后極部0.7054±0.020a,b對照組10前部1.4419±0.020c后極部1.5014±0.015c誘導(dǎo)15d后實驗組10前部0.2334±0.021a,b后極部0.2078±0.019a,b對照組10前部1.4301±0.016c后極部1.4658±0.018c誘導(dǎo)30d后實驗組10前部0.1517±0.011a,b后極部0.1478±0.012a,b對照組10前部1.4794±0.021c后極部1.5217±0.019c

Seko等[4]用酶聯(lián)免疫吸附法發(fā)現(xiàn)在FDM鞏膜后極部bFGF的表達明顯降低,而在視網(wǎng)膜-色素上皮-脈絡(luò)膜的表達與非FDM組類似。Rohrer等[5]研究認(rèn)為bFGF對近視的眼軸延長提供了一個停止信號。他對FDM眼行玻璃體或球結(jié)膜下注射bFGF均能抑制FDM的形成,而且與bFGF成劑量相關(guān)性。毛俊峰等[7]發(fā)現(xiàn):玻璃體腔注射bFGF能有效抑制雞FDM形成,同時下調(diào)后極部鞏膜MMP-2 mRNA表達。認(rèn)為外源性bFGF要想暢通無阻地通過視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜直接作用于鞏膜,調(diào)控MMP-2 mRNA表達是不可能的。魏海英等[6]研究發(fā)現(xiàn):在雞的形覺剝奪性近視模型中,bFGF在實驗眼、對照眼均有表達,但實驗眼染色濃于對照眼,視網(wǎng)膜外層染色濃于內(nèi)層,表明FDM中有bFGF的參與。bFGF的免疫活性水平在FDM眼視網(wǎng)膜外層中升高。故推測形覺剝奪這種異常的視覺環(huán)境使視網(wǎng)膜細(xì)胞表達bFGF基因,產(chǎn)生bFGF后作用于剝奪眼而產(chǎn)生上述變化。以上實驗中bFGF對FDM的影響表明: bFGF也許代表作用于RPE的視網(wǎng)膜信息;bFGF可能通過某些中介因子調(diào)控鞏膜MMP-2 mRNA表達,影響FDM形成。

在本實驗中,通過觀察不同誘導(dǎo)時間、不同誘導(dǎo)部位的RPE細(xì)胞中的bFGF動態(tài)表達,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照眼相比,bFGF的表達輕度下降,有顯著差異。但是,無論在實驗組還是在對照組,前部RPE的bFGF表達與后極部RPE的bFGF表達無顯著差異。這表明:在透鏡誘導(dǎo)豚鼠近視眼形成過程中,RPE細(xì)胞中bFGF活性在整體RPE細(xì)胞中普遍下降,而不是以后極部為主;說明bFGF與近視眼后極部后鞏膜葡萄腫的病理性變化無直接聯(lián)系。而Gentle則發(fā)現(xiàn)鞏膜中的bFGF受體FGFR-1的mRNA水平上調(diào),說明bFGF也許通過與其他因子或傳導(dǎo)信號相結(jié)合對近視眼后極部變化的形成發(fā)揮著間接作用。

本研究由于時間有限,只對RPE細(xì)胞中bFGF及bFGF mRNA的表達進行了半定量及定量研究。RPE細(xì)胞中bFGF有陽性表達,參與豚鼠實驗性近視眼的形成,但是哪些信號使bFGF表達發(fā)生改變,而bFGF又是通過怎樣的途徑到達鞏膜,引起鞏膜改變的信號又是什么,還有待于進一步研究。另外由于時間緊迫,未對“RPE-脈絡(luò)膜級聯(lián)系統(tǒng)”[8]中的脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞進行研究,還有待下一步實驗進行完善。

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Altered bFGF expression in retinalpigment epithelial cells from guinea pigmodel with early stage of experimentallyinducedmyopia

Bo-Yu Chen1,Chao-Ying Wang1,W ei-Yi Chen2, Ying-Qing Liu1,Lan Hao1

1Department of Ophthalmology,Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082,Hebei Province,China;2Institute of Biomechanics Research,Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030001,Shanxi Province,China

Foundation item:Natural Scinece Foundation of Hebei Province (No.H2012505009)

Bo-Yu Chen.Department of Ophthalmology, Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082,Hebei Province,China.chenby2190@126.com

·AIM:To determine the expression of basic fib rob last grow th factor(bFGF)in retinal pigment epithelial(RPE) cells from anterior and posterior part of guinea pig eyes with lens-induced myopia(LIM).·METHODS:Thirty two-w eek-aged guinea pigs were randomly divided into three groups,group A,group B and group C.Another five guinea pigs(10 eyes)w ere chosen as control group without any treatment.Concave lenses were worn by the 30 guinea pigs on either side of their eyes.After 6,15 and 30d,the lenses were removed and optometry and axial length were used to make sure the myopia had form ed.The retinal pigment epithelial cells of each group were cultured and passaged in vitro using enzymatic digestion method.The cultured cells at 3～6 generation was detect by immunocytolchemistory, Real-Time PCR and Western blotting to detect the expression of bFGF.·RESULTS:The expression of bFGF was located in the cytoplasm and nucleus.The results of immunocytolchemistory,Real-Time PCR and Western blotting showed that the expression of bFGF were detected at anterior and posterior part of eyes from experiment group and control group,the expression in experiment group at both part was significantly lower than those in control group(P＜0.05).The positive percentage of expression of bFGF in experiment group decreased with the induced time(P＜0.05).The expression of bFGF from anterior part of both experiment group and control group was as the same as that from posterior part of them selves(P＞0.05).·CONCLUSION:The expression of bFGF from anterior and posterior part of experiment group was lower than those of control group.

guinea pig;retinal pigment epithelial cells;basic fibroblast growth factor; immunocytochemistry;Rea l-Time PCR Analysis; Western blotting

河北省自然科學(xué)基金資助項目(No.H2012505009)

作者單位:1(050082)中國河北省石家莊市,白求恩國際和平醫(yī)院眼科;2(030001)中國山西省太原市,太原理工大學(xué)生物力學(xué)研究所

陳博宇,女,博士,副主任醫(yī)師,研究方向:近視、白內(nèi)障、眼底病。

陳博宇.chenby2190@126.com

2015-05-13

2015-10-23

:Chen BY,Wang CY,Chen WY,et al.Altered bFGF expression in retinal pigment epithelial cells from guinea pig model with early stage of experimentally-induced myopia.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015;15(11):1857-1861

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.05

Received:2015-05-13 Accepted:2015-10-23

方法:兩周齡豚鼠30只隨機分為A組、B組、C組,每組10只,再隨機選取5只10眼正常兩周齡豚鼠不作任何干預(yù),作為正常對照眼。選取任意眼戴一-10.00D凹透鏡,分別飼養(yǎng)6、15、30d后除去鏡片,驗光及測眼軸長度確定近視形成后,采用細(xì)胞酶消化法培養(yǎng)豚鼠的前部及后極部RPE細(xì)胞,取3～6代RPE細(xì)胞進行免疫細(xì)胞化學(xué)、實時熒光定量PCR、Western-blot蛋白印跡法檢查前部及后極部RPE細(xì)胞中bFGF表達變化。

結(jié)果:bFGF的表達定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核。免疫細(xì)胞化學(xué)、實時熒光定量PCR、Western-blot蛋白印跡法結(jié)果均表明:A、B、C三組實驗眼和對照眼前部及后極部RPE細(xì)胞均有bFGF的表達,實驗組前部及后極部與對照組相應(yīng)前部及后極部比較,實驗組中bFGF的陽性率低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而且,隨著誘導(dǎo)時間的推移,實驗組的陽性率逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),對照組的陽性率不變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);但實驗組和對照組各組自身前部及后極部比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

結(jié)論:實驗組前部及后極部與對照組相應(yīng)前部及后極部比較,bFGF的表達顯著低于對照組。